高产赖氨酸菌株FML8611特性的研究

FML8611是从黄色短杆菌FM84—415经诱变选育得到的一株新的高产赖氨酸菌株。它具有高丝氨酸营养缺陷、S—(2—氨基乙基)—L—半胱氨酸抗性、对利福平不敏感等遗传特性,还具有耐高糖、产赖氨酸稳定等特点。在适宜的条件下,FML8611摇瓶发酵的平均产量为78.9mg/ml,糖酸转化率为46.2％。     

L-苏氨酸产生菌的选育

以亚硝基胍(MNNG)诱变处理大肠杆菌ASI．358,获得蛋氨酸缺陷型(Met-)突变株,从中得到一株B2851菌,能在培养基中积累少量苏氨酸。通过连续诱变,得K1-73菌株(Met-),在5％葡萄糖与DL-蛋氨酸舔加量为75mg／l的条件下,能够积累3．5mg／ml L-苏氨酸。同样以MNNG诱变处理钝齿棒状杆菌C. crtenalum ASI．542,获得抗a一氨基一β一羟基戊酸(AHV)突变株1770林,其中6％菌株能够积累少量苏氨酸。选得LR—1458菌产L一苏氨酸(1mg／ml。 对该菌逐步诱变,得一株抗8mg／ml AHV及蛋氨酸缺陷型双重突变株(AHV,Mer) LRA-96,其L一苏氨酸产率与亲株比较有明显提高,达3．5mg／ml。连续再诱变并结合单菌落分离选育,得一突变株m一85(AHV,Met-),能在培养基中积累13mg／ml L-苏氨酸。试验表明,连续诱变处理是选育L一苏氨酸高产菌株有效手段之一。     

产L-苏氨酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能

【背景】大肠杆菌由于生长性能优良、遗传背景清晰,常被用作苏氨酸生产菌。【目的】敲除大肠杆菌Escherichia coli THR苏氨酸合成途径的非必需基因,并异源表达苏氨酸合成必需的关键酶,构建一株苏氨酸高产菌株。【方法】利用FLP/FRT重组酶系统,敲除E. coli THR中lysC、pfkB和sstT,同时进行谷氨酸棒杆菌中lysC~(fbr)、thrE和丙酮丁醇梭菌中gapC的重组质粒构建并转化到宿主菌中。【结果】以E. coli THR为出发菌株,敲除其苏氨酸合成途径中表达天冬氨酸激酶Ⅲ (AKⅢ)的基因lysC、磷酸果糖激酶Ⅱ基因pfkB及苏氨酸吸收蛋白表达基因sstT,使菌株积累苏氨酸的产量达到75.64±0.35g/L,比出发菌株增加9.9%。随后异源表达谷氨酸棒杆菌中解除了反馈抑制的天冬氨酸激酶(lysC~(fbr))、苏氨酸分泌转运蛋白(thrE)及丙酮丁醇梭菌中由gapC编码的NADP+依赖型甘油醛-3-磷酸脱氢酶,获得重组菌株E. coli THR6菌株。该菌株积累苏氨酸的产量提高到105.3±0.5 g/L,糖酸转化率提高了43.20%,单位产酸能力提高到5.76 g/g DCW,最大生物量为18.26 g DCW/L。【结论】单独敲除某个基因或改造某个途径不能使苏氨酸大量合成和积累,对多个代谢途径共同改造是构建苏氨酸工程菌的最有效方法。     

lysC定点突变及lysC、asdA串联表达对谷氨酸棒杆菌L-苏氨酸积累的影响

lysC、asdA基因分别编码的天冬氨酸激酶(Aspartate kinase,AK)和天冬氨酸半醛脱氢酶(Aspartate semi-aldehyde dehydrogenase,ASD)是L-苏氨酸合成途径中两个关键限速酶基因,其中AK受到代谢产物赖氨酸与苏氨酸的协同抑制。以选育获得的一株谷氨酸棒状杆菌T11(Corynebacterium glutamicum T11)为出发菌株,通过构建lysC-asdA串联表达盒,并对其关键限速酶基因lysC进行定点突变,突变位点为Ala279Thr,获得抗反馈抑制突变型编码基因lysCr-asdA,将其插入含强启动子tac的穿梭表达载体pZ8-1中成功构建串联表达质粒pZ8-1-lysCr-asdA转化出发菌株,筛选获得工程菌株T11/pZ8-1-lysCr-asdA。摇瓶发酵其L-苏氨酸产量达到7.18 g/L,较出发菌株提高27.8%。进一步的30 L发酵罐补料分批发酵结果显示,发酵60 h L-苏氨酸产量达65.5 g/L,糖酸转化率达到39.5%,较出发菌株分别提高29.5%和33.9%,为后续的进一步构建高产L-苏氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌株提供强有力的基础。     

黄色短杆菌变异株AN78的发酵生产L-精氨酸的研究

以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AG77(AHVr,TA^r,SG^r)[1]为诱变出发菌株,经亚硝基胍(NTG)诱变处理和选育,获得一株能够积累大量L-精氨酸的菌株AN78(AHVr,TAr,SG,His-)。AN78菌株在20L发酵罐中,以葡萄糖为碳源,以玉米浆、硫酸铵等为氮源的培养基中培养4d,产效率可达61．1g／L,对糖转化率20．2％,与AG77菌株相比较,分别提高了95％和39．3％。发酵液中L—精氨酸的提取收率为71％。     

影响青霉产聚乙烯醇降解酶营养因素的研究

在培养基中没有聚乙烯醇 (PVA)及有PVA存在的情况下 ,考察了酵母粉、2 0种氨基酸和部分维生素对一株青霉WSH0 2 2 1产PVA降解酶的影响。当培养基中无PVA时 ,以酵母粉为氮源时 ,该菌株可产生 38 9U L的PVA降解酶 ;加入PVA后 ,酶活提高了 3 3倍 ,表明该菌株所产的PVA降解酶是可诱导的。进一步研究发现 ,不管培养基中是否存在PVA ,若没有苏氨酸存在 ,该菌株正常生长 ,但不能产生PVA降解酶 ,表明苏氨酸是该菌株产生PVA降解酶所必需的 ,而非生长所必需。在苏氨酸添加浓度为 10mg L到 2 0mg L的范围内 ,该菌株所产PVA降解酶的酶活随着培养基中苏氨酸浓度的增大而呈现上升趋势。     

大肠杆菌TdcC、SstT和LIV-1系统缺失对胞外L-苏氨酸积累的影响

【目的】比较分析苏氨酸吸收系统TdcC、SstT和LIV-1缺失对大肠杆菌吸收和积累胞外苏氨酸的影响。【方法】从菌株E.coli W3110出发,敲除tdcC、sst T和liv J基因,构建Tdc C、SstT和LIV-1系统单缺失和多缺失菌株,将过量表达苏氨酸操纵子基因的重组质粒pKKthr AC1034TBC分别转入原始菌和重组菌,考察各菌株吸收和积累胞外苏氨酸的能力。【结果】敲除tdc C和sst T基因的重组菌T04的苏氨酸吸收能力比原始菌W3110降低了43.28%,T04(pKKthr AC1034TBC)胞外苏氨酸积累量最高达到1.09 g/L,比对照菌W3110(pKKthr AC1034TBC)高出172.5%。敲除tdcC、sstT和livJ基因的重组菌T07的苏氨酸吸收能力比T04降低了12.97%,然而T07(pKKthr AC1034TBC)胞外苏氨酸积累量最大为0.63 g/L,与T04(pKKthr AC1034TBC)相比降低了42.2%。【结论】阻断Tdc C和Sst T系统,能有效降低大肠杆菌吸收苏氨酸的能力,提高苏氨酸的胞外积累量。阻断LIV-1系统,虽然能减少大肠杆菌对苏氨酸的吸收,却不利于菌株积累胞外苏氨酸。     

多酶系曲霉菌种选育通过鉴定

兰州大学生物系于1983年承担了甘肃省科委下达的“多酶系曲霉菌种选育”课题,于85年7月3日在兰州通过鉴定。甘—8412菌株的谷氨酰胺酶、肽酶,碱性蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶、β—淀粉酶等主要酶活力,分别较亲本提高20—50％;低温菌种甘—8477的谷氨酰胺酶活力较亲本提高41.78％,它适宜于西北、东北等     

利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌

利用Red重组技术构建不同基因突变的L-苏氨酸工程菌大肠杆菌ITHR,研究单敲除metA、ilvA和双敲除metA、ilvA基因后对L-苏氨酸积累的影响。应用质粒pKD46介导的Red同源重组系统,通过第一次同源重组将拟敲除基因替换为氯霉素抗性基因,再通过重组酶在FRT位点发生第二次同源重组,消除抗性基因,成功敲除了菌株ITHR体内苏氨酸合成的代谢旁路途径中的metA和ilvA基因,构建了三株不同的基因突变株。将携带苏氨酸操纵子的工程质粒pWYE065电转化入敲除不同基因的突变株中,构建基因工程菌。经5 L发酵罐发酵产酸实验,未敲除任何基因的菌株ITHR/pWYE065 L-苏氨酸的产量为5.55±0.51 g/L,metA基因单敲除菌株ITHR△metA/pWYE065 L-苏氨酸产量为9.77±1.83 g/L,ilvA基因单敲除菌株ITHR△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸产量为8.65±1.42 g/L,同时敲除ilvA和metA基因的菌株ITHR△metA△ilvA/pWYE065 L-苏氨酸的产量增加到13.6±1.14 g/L。通过敲除L-苏氨酸的旁路代谢途径中的关键酶的基因,可以增强L 苏氨酸积累的效果,为L-苏氨酸工程菌的进一步改造奠定了基础。     

一株AEC^hrL—赖氨酸产生菌

从乳糖发酵短杆菌Brevibacterium Lactofermentum2645菌株出发选育L-赖氨酸产生菌,经分离复壮后,用硫酸二乙酯(DES)诱变处理,由添加S-(2-氨基乙基)—L—半胱氨酸(AEC)和L-苏氨酸的药物平板定向筛选,最后获得了一株L—赖氨酸高产菌E_(16-2)(AHV~(hr)SAM~gAEC~(hr))。进而通过正交试验、工艺条件试验最终获得了该菌株的最佳发酵条件,并考查了在此条件下的L-赖氨酸发酵过程,结果表明该菌具有生长、耗糖、产酸速度快、发酵周期短的明显特点。