小菜蛾PGRP-S2基因的克隆表达及功能分析

肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein,PGRP)对于昆虫来说是一种高度保守的病原识别蛋白。为阐明PGRP-S2在小菜蛾Plutella xylostella抵抗病原微生物过程中的作用,本研究结合RT-PCR和RACE技术克隆得到小菜蛾PGRP-S2基因的cDNA全长序列,命名为PGRP-S2(GenBank登录号:MG570190)。生物信息学分析结果表明,PGRP-S2的开放阅读框为588 bp,编码195个氨基酸;蛋白质预测分子量为21.46 kDa,理论等电点为8.46;编码蛋白具有PGRP超家族保守结构域和酰胺酶结构域,是典型的肽聚糖识别蛋白,包含一条信号肽,不存在跨膜结构;同源序列比对和系统进化树分析表明PGRP-S2与家蚕Bombyx mori的BmPGRP-S 1进化距离最近。利用大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)高效表达重组蛋白PxPGRP-S2,利用倒置显微镜及平板涂布观察重组蛋白对大肠杆菌E.coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的作用,结果表明PxPGRP-S2蛋白能够与两种细菌发生结合并凝集细菌,但不具备直接杀菌功能。本研究为进一步研究基于PGRP-S2介导的小菜蛾免疫防御反应提供基础。     

一个调控抗菌肽表达的小菜蛾肽聚糖识别蛋白(PxPGRP-SA)

【目的】肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)是昆虫免疫系统中一类重要的模式识别蛋白。本研究旨在阐明经苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis侵染后,小菜蛾Plutella xylostella PGRP-SA基因(命名为Px PGRP-SA)在体内的表达模式和对抗菌肽基因的表达调控。【方法】本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析B.thuringiensis侵染小菜蛾幼虫后Px PGRP-SA的转录模式,通过RNAi技术结合抗血清封闭实验检测Px PGRP-SA对小菜蛾抗菌肽基因的表达调控作用。【结果】qRT-PCR检测表明,小菜蛾4龄幼虫在注射具有活性的B.thuringiensis 6 h后,Px PGRP-SA在脂肪体和血细胞中表达量迅速上升,其中脂肪体中的表达量在注射24 h后达到高峰,而在血细胞中的表达量在18 h后达到高峰。RNAi沉默小菜蛾4龄幼虫Px PGRP-SA的转录后,可显著降低小菜蛾脂肪体中cecropin,moricin-2,lysozyme和defensin 4个抗菌肽基因及Dorsal和Sptzle基因的mRNA转录水平;注射anti-Px PGRP-SA封闭小菜蛾体内Px PGRP-SA的活性后,也可降低小菜蛾脂肪体中4个抗菌肽基因的mRNA转录水平;Px PGRP-SA转录沉默后,同时导致添食B.thuringiensis的小菜蛾幼虫的存活率明显降低。【结论】Px PGRP-SA参与了小菜蛾体内抗菌肽cecropin,moricin-2,lysozyme和defensin基因的表达调控,并在免疫防御B.thuringiensis的侵染过程中起了重要的作用。     

亚洲玉米螟酚氧化酶原的原核表达和性质分析

【目的】昆虫体内酚氧化酶原（PPO）是一种重要的天然免疫蛋白,参与昆虫的体液免疫和细胞免疫过程。本研究采用原核表达体系,大量表达可溶且具有活性的重组PPO蛋白,可用于各种酚氧化酶（PO）抑制剂的筛选,从而为创制抑制昆虫免疫系统的新型杀虫剂提供条件。【方法】利用从亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis 5龄幼虫体内克隆获得PPO基因,构建了pET-28b-PPO原核表达载体,在大肠杆菌Escherichia coli中重组表达了亚洲玉米螟PPO蛋白;采用Ni-NAT亲和层析柱快速纯化目的蛋白,进行了Western杂交鉴定;测定分析了重组PPO蛋白激活为PO后的酶学性质以及不同金属离子（Mg²⁺,Cu²⁺和Fe²⁺）对PPO二级结构的影响。【结果】融合蛋白PPO得到了表达和纯化。重组PPO蛋白激活为PO后最适反应温度为30℃,最适pH为7.2,以L-DOPA为底物时PO催化反应的V_max为140.8 U/mg·min,Km为2.96 mmol/L。Fe²⁺存在的情况下重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著增加至53.7%±4.6%,α-螺旋结构成分则显著下降至2.6%±1.2%（P<0.05）;有Mg2+存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降,α-螺旋结构成分稍有上升。有Cu²⁺存在的情况下,重组PPO蛋白中β-折叠结构成分显著下降为10.0%±1.6%,而α-螺旋结构成分则上升至35.3%±6.9%。【结论】结果说明不同金属离子对重组PPO蛋白的二级结构有显著影响。     

根虫瘟霉不同菌株对小菜蛾幼虫血淋巴酚氧化酶原的激活作用

在对小菜蛾Plutella xylostella幼虫血淋巴酚氧化酶原的存在部位及免疫激活作用特点研究的基础上,比较了根虫瘟霉Zoophthora radicans不同菌株对酚氧化酶原激活系统的免疫激化及防御作用的差异。研究发现, 酚氧化酶原主要位于小菜蛾幼虫血细胞膜及血细胞裂解液中,极少存在于血浆中。在免疫激活剂昆布多糖存在下,分别测得小菜蛾幼虫血细胞碎片、血细胞裂解液和血浆的酚氧化酶活性为26.80 U,16.68 U和2.53 U。酚氧化酶原显著地受血浆和昆布多糖同时存在的激活,但两者单独存在时对酚氧化酶原的激活作用较弱。根虫瘟霉菌丝裂解液对酚氧化酶原有不同程度的激活作用,其激活作用在有血浆存在时显著增强,其酚氧化酶活性可提高2.9～3.4倍。各菌株间对酚氧化酶原的激活作用则以ARSEF1342菌株最强,ARSEF2699和F99101菌株次之,ARSEF1100菌株最弱。被激活的酚氧化酶可粘附于根虫瘟霉菌丝上并能产生黑化反应,各菌株间酚氧化酶粘附于ARSEF1342菌株的能力最强,粘附于ARSEF2699和F99101菌株的次之,粘附于ARSEF1100菌株的最弱。但酚氧化酶粘附于昆布多糖的能力显著强于各虫霉菌株,表明各菌株在一定程度上能逃避寄主的免疫识别;各菌株激活酚氧化酶原及酚氧化酶粘附于菌株强弱,与对小菜蛾毒力呈负相关性,表明高毒力菌株具有易逃避寄主免疫识别的趋向。     

棉铃虫不同虫态及虫龄血淋巴中酚氧化酶活力的比较

分别测定了棉铃虫Helicoverpa armigeraHübner不同虫态及虫龄血清和血细胞中酚氧化酶(phenoloxidase,PO)的活力。结果显示血清和血细胞中都有酚氧化酶活性,且血细胞中高于血清中。不同虫态及虫龄的血清和血细胞中酚氧化酶活力有很大的不同,血清和血细胞中酚氧化酶活力变化规律一致。3龄幼虫酶活力最高,5龄幼虫最低。酶活力大小依次为:3龄幼虫>预蛹>4龄幼虫>蛹>5龄幼虫     

昆虫酚氧化酶原激活酶研究

昆虫酚氧化酶原激活酶(Prophenoloxidase activating proteinase,PAP)是酚氧化酶原激活过程中的一个关键酶,是昆虫先天性体液免疫体系的重要组成部分。外界的免疫刺激能够诱导级联反应上游的蛋白对酚氧化酶原激活酶的前体进行剪切激活,而激活后的酚氧化酶原激活酶能够将无活性的酚氧化酶原剪切激活为有活性的酚氧化酶并最终生成细胞毒素物质来消灭外源物。本文综述了昆虫酚氧化酶原激活酶的结构与特性及其在酚氧化酶原级联激活系统中的作用机制,并探讨了寄生蜂对寄主昆虫酚氧化酶原激活酶的调控。     

棉铃虫血淋巴酚氧化酶活性的微量测定

昆虫血淋巴黑化的形成由激活酚氧化酶原的级联系统所引发 ,酚氧化酶在昆虫体液免疫中起着重要作用。用抗凝剂从棉铃虫血淋巴中分离获得了血浆及完整的血细胞 ,以L DOPA为底物 ,牛胰蛋白酶为激活剂 ,测定了血浆及血细胞裂解液中酚氧化酶及酚氧化酶原的活性。结果表明 ,血浆及血细胞中两者都有一定量的分布。这一昆虫血淋巴酚氧化酶的微量测定方法 ,所需样品量少 ,耗时短 ,简便易行。     

棉铃虫酚氧化酶原基因的克隆、序列分析和组织表达

利用RT-PCR和RACE方法,获得了棉铃虫Helicoverpa armigera酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)基因一个亚型cDNA的完整序列。该序列全长2 405 bp,含有一个2 097 bp的开放阅读框,编码一个由698个氨基酸残基组成的蛋白质。推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO2基因相应氨基酸序列有较高的同源性(76％～80％),同时该序列具有铜离子结合位点等PPO基因所具有的典型特征。组织特异性表达分析表明,该基因在棉铃虫血细胞、体壁和中肠中均有表达。     

抑太保对亚洲玉米螟表皮酚氧化酶及几丁质酶活力的影响

采用饲喂法,抑太保(Atabron,IKI-7899)对亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis幼虫的LC₅₀约是灭幼脲Ⅰ号的1/10.体内和体外实验表明,抑太保及灭幼脲Ⅰ号均能导致幼虫表皮酚氧化酶及几丁质酶活力显著增高.与对照相比,饲喂抑太保及灭幼脲Ⅰ号,五龄幼虫表皮酚氧化酶活力分别增长276.00%和28.00%、几丁质酶活力分别增长42.25%和13.62%;腹腔注射抑太保及灭幼脲Ⅰ号,五龄幼虫表皮酚氧化酶活力分别增长74.86%和37.98%、几丁质酶活力分别增长68.18%和28.86%.我们认为,酚氧化酶及几丁质酶活力的增高应是抑太保及灭幼脲Ⅰ号导致玉米螟死亡的重要原因.     

两种多糖对日本沼虾酚氧化酶活力的影响

在饲料中分别添加 1‰的云芝多糖和虫草多糖 ,对日本沼虾进行投喂 ,通过连续测定日本沼虾血清中的酚氧化酶活力 ,研究两种多糖对日本沼虾免疫机能的作用。结果表明 ,在平均水温为 2 3 8℃± 3 8℃时 ,云芝组、虫草组分别较对照组提高了 34 52 %、84 62 % ;在平均水温为 1 0 8± 2 4℃时 ,云芝组和虫草组分别较对照组提高了30 0 2 %、5 1 2 % ,因而云芝多糖和虫草多糖能明显地增强日本沼虾血清的酚氧化酶活力。另经实验表明 ,在王雷所确立的酚氧化酶活力的检测条件下 ,其PO活力为 8 3units/mL ,而在Horowitz所确立的检测条件下 ,其PO活力为2 90units/mL ,并且后者检测方法重复性好 ,能较好地反映日本沼虾的免疫状态。     

A short-type peptidoglycan recognition protein from Asian corn borer,Ostrinia furnacalis (Guenée) exhibits antibacterial activity,and regulates the expression of antimicrobial peptides

Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) discriminate and bind peptidoglycans by acting as pattern recognition receptors (PRRs) in insects, and function pivotal roles in innate immune response. In the present study, we cloned a full-length PGRP gene designed as OfPGRP8 from the Asian corn borer, Ostrinia furnacalis (Guenée). Its mRNA exhibited the highest abundance in fat body, and its expression level upregulated dramatically after bacterial challenges. Purified recombinant OfPGRP8 exhibited intensive binding capacity to peptidoglycans from Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus. Additionally, recombinant OfPGRP8 could inhibit the growth of S. aureus, M. luteus. However, recombinant OfPGRP8 could not cause agglutination of S. aureus, M. luteus or Escherichia coli. Furthermore, we also demonstrated that OfPGRP8 may be involved in modulating the signaling pathway of antimicrobial peptides (AMPs) synthesis. In sum, our results provided evidence that OfPGRP8 discriminates peptidoglycans from microbes and acts as a PRR to initiate downstream immune signaling pathways.     

肽聚糖识别蛋白抗菌活性及参与炎症的免疫作用

哺乳动物肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins, PGRPs)是一类可识别肽聚糖的模式识别受体,在先天免疫应答中发挥重要的识别和调节功能。PGRPs通过与肽聚糖结合,诱导激活细菌双组分系统(two-component systems, TCSs)如CssR-CssS、CpxA-CpxR等,诱导氧化应激、硫醇应激和金属应激等反应发挥抗菌活性。现对PGRPs的抗菌活性及其与抗生素的杀菌机制进行比较,旨在为疾病的防治提供理论依据。     

颗粒体病毒对不同蔬菜上小菜蛾实验种群的控制作用

通过组建施用颗粒体病毒Plutella xylostellagranulosis virus(PxGV)后4种十字花科蔬菜上的小菜蛾Plutella xylostellaL.实验种群生命表发现:小菜蛾颗粒体病毒除了能引起幼虫感病死亡外,还能显著地降低成虫的产卵量,推迟产卵高蜂1~2 d,但对化蛹及雌蛾寿命无显著影响。在种群水平上,病毒对小菜蛾的控制作用综合表现为压低了小菜蛾种群增长趋势指数,在菜心、芥蓝、芥菜和小白菜上小菜蛾实验种群增长趋势指数在分别为13.7,12.3,10.7和22.7,病毒对小菜蛾种群的干扰作用控制指数(IIPC)分别为0.334,0.177,0.280和0.433,表明病毒对小菜蛾种群的控制能力受到寄主植物的影响,在芥蓝上控制能力最强,其次为芥菜和菜心,而小白菜最次。     

Rapid Functional Analysis in Xenopus Oocytes of Po Protein Adhesive Interactions

We have developed a coupled Xenopus oocyte expression system for evaluating the functional effects of mutations in known or suspected adhesion molecules, which allows for a very rapid assessment of intercellular adhesion. As a model protein, we first used Protein zero (Po), an adhesion molecule that mediates self-adhesion of the Schwann cell plasma membrane to form compact myelin in the mammalian PNS. A wide variety of mutations in Po cause certain human peripheral neuropathies, such as the Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) type 1B and Dejerine-Sottas syndrome (DSS). After wild-type Po mRNA is injected, the protein is synthesized and correctly targeted to the oocyte cell surface. When two oocytes are paired, wild-type Po redistributes and concentrates at the cell-cell apposition region, and by electron microscopy, the oocyte pairs show close cell-cell appositions and are devoid of the microvilli that are observed in uninjected oocyte pairs. These are hallmark features of highly adhesive cell:cell interfaces. Several point mutations in Po were engineered, corresponding to the molecular defects in the CMT type 1B or DSS. The proteins encoded by these mutations reached the cell surface but failed to concentrate at the oocyte interface. Po carrying a point mutation that is found in DSS is not targeted on the plasma membrane and fail to accumulate at the cell-cell contact site.     

小菜蛾颗粒体病毒对小菜蛾防治作用的评价

用以作用因子组配的生命表,种群趋势指数和控制指数评价小菜蛾颗粒体病毒对小菜蛾种群动态的作用。结果表明,施用该病毒对小菜蛾种群动态有明显的控制作用,种群趋势指数为０．９７,干扰作用控制指数为０．１９,即施用病毒后,其种群趋势指数相当于对照的０．１９,施用化学杀虫剂的种群趋势指数为７．２０,干扰作用控制指数为１．４３,即种群趋势指数将增长为对照的１．４３倍。     

菜蛾斑蝥素受体PP2A催化亚基基因的原核表达与纯化

为获得菜蛾斑蝥素受体PP2Ac的蛋白,支持斑蝥素受体结合机理等相关研究,本试验以菜蛾cDNA为模板,利用PCR方法扩增得到菜蛾PP2Ac基因,将PP2Ac基因连接至经Hind III与Bam HI双酶切处理的pET-30a原核表达栽体中,获得重组质粒并将其命名为pET30a-PX-PP2Ac。将pET30a-PX-PP2Ac化至大肠杆茵BL21中进行诱导表达获得的目的蛋白后,使用Ni-琼脂糖柱纯化对重组蛋白进行纯化。结果表明,菜蛾PP2Ac基因可以在大肠杆菌中表达,目的蛋白在不同的温度下均以包涵体形式存在。优化后的诱导表达条件是IPTG浓度0.2mM和温度30℃,目的蛋白大小约38KD。     

小菜蛾热休克蛋白基因的鉴定及其表达模式分析

热休克蛋白(heat shock protein, HSP)在昆虫应对外界胁迫刺激时起着重要作用。为了系统研究小菜蛾Plutella xylostella HSP基因家族, 根据家蚕的HSP蛋白序列, 采用本地Blast程序对小菜蛾全基因组数据库进行同源序列检索, 从小菜蛾基因组数据库中鉴定了25个HSP基因, 包括2个HSP90、 8个HSP70和15个sHSP（small heat shock protein, sHSP）基因。小菜蛾、 家蚕Bombyx mori、 黑腹果蝇Drosophila melanogaster和赤拟谷盗Tribolium castaneum的HSP系统进化分析显示, 昆虫的小分子量热休克蛋白sHSP具有很强的种属特异性, HSP70家族的保守性比sHSP强。小菜蛾HSP基因表达模式分析显示, 与敏感品系对比, 抗性品系（抗毒死蜱和抗氟虫氰品系）中HSP基因具有不同的表达模式。小菜蛾1, 2和3龄幼虫HSP基因表达模式较为接近, 而与4龄幼虫中的表达模式相差较大; 4龄幼虫和蛹中的表达模式相近; 雌成虫和雄成虫中的表达模式显著不同, 与果蝇精子形成有关的两个热休克蛋白HSP23和HSP27基因［分别为CCG003980.1 (Px23.5)和CCG005412.2 (Px27.5)］, 在小菜蛾雄成虫中的表达量显著高于雌成虫。研究结果表明小菜蛾HSP基因不仅在杀虫剂抗性、 发育分化, 甚至在生殖上均可能起着重要的作用。本研究为深入研究小菜蛾HSP与生长发育、 抗逆行为的相互关系奠定了基础。     

Distribution of multiple peptidoglycan recognition proteins in the tissues of Pacific oyster, Crassostrea gigas

Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) are pattern recognition receptors that specifically bind to peptidoglycans, a major component of bacterial cell wall. Generally, PGRPs are responsible for recognition of bacterial invasion in invertebrates. Full length cDNAs of PGRP, designated as CgPGRP-S1S, -S1L, -S2 and -S3, were identified from the Pacific oyster, Crassostrea gigas. Homology and domain searches classified these CgPGRPs as short-type PGRPs for extracellular PGN recognition. Amidase activity was predicted in all CgPGRPs, and defensin-like domains were found in CgPGRP-S1S and -S1L, suggesting that they may also function as antimicrobial proteins. Although phylogenetic analysis indicated that CgPGRPs are closely related to each other, they showed different tissue expression patterns; CgPGRP-S1S in the mantle and the gill, -S1L in the mantle, -S2 in the hemocytes and -S3 in the digestive diverticula. The CgPGRPs seem to survey bacterial invasion in their corresponding expression tissues. This is the first report of the possibility that bivalve mollusks have PGN recognition systems as suggested by the identification of multiple PGRPs distributed in various tissues.     

小菜蛾对杀螟丹抗性遗传的研究

利用室内选育的抗杀螟丹小菜蛾Plutella xylostella (L.)品系和敏感品系研究了该品系的抗性遗传形式,结果表明,小菜蛾对杀螟丹的抗性形式为常染色体多基因遗传,并呈不完全显性。该品系对６种常用杀虫剂的抗性谱测定结果表明,对杀虫双有较严重的正交互抗性;对敌敌畏、杀扑磷有低度交互抗性;对溴氰菊酯、灭多威和叶蝉散等药剂无交互抗性。还发现该品系对杀螟丹的抗性与乙酰胆碱酯酶和羧酸酯酶活性无关。