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相似文献
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1.
利用PCR技术克隆截短型HPV58 L1基因并重组入杆状病毒表达系统穿梭质粒pFastBac-Htb,通过转座反应,将目的基因片段重组入杆状病毒基因组,分离重组的Bacmid DNA, 并转染Sf-9昆虫细胞,收集被转染的Sf-9细胞,提取细胞蛋白,SDS-PAGE检测可见在大约58Kda处出现一新生蛋白条带,Western blot 证实为HPV58L1蛋白。用ProBondTM纯化系统纯化所表达的蛋白。小鼠红细胞凝集试验证实纯化的蛋白可介导小鼠红细胞凝集,透射电镜观察证实纯化蛋白可自组装成VLP。结果表明昆虫杆状病毒表达系统可高效表达截短型HPV58L1蛋白,纯化后的截短型HPV58L1蛋白在体外可自组装VLP,并具有介导小鼠红细胞凝集的生物学活性。  相似文献   

2.
为鉴定富含脯氨酸核受体辅调节蛋白1(PNRC1)分子的核定位信号序列(nuclear localization signal sequence, NLS),在生物信息学方法预测的基础上,先构建野生型PNRC1及删除预测NLS的PNRC1突变体的绿色荧光蛋白(GFP)重组表达载体,转染细胞后通过激光共聚焦显微镜观察PNRC1分子在删除预测NLS后细胞内的定位变化.然后,将预测的NLS编码序列直接连到GFP表达载体上,以及将预测的NLS加到胞浆蛋白上构建其GFP重组表达载体,转染细胞,观察预测的NLS能否把构建的重组体都带到细胞核内.结果显示,删除PNRC1中预测的NLS后,其定位从细胞核中变为主要定位在细胞浆中,而预测的NLS能把GFP或胞浆中的蛋白带到细胞核中.研究表明,预测的NLS为PNRC1分子真正的NLS.  相似文献   

3.
目的 构建谷胱甘肽转硫酶(GST)与EGFP相融合的新型蛋白质示踪载体--pGST-EGFP,以用于蛋白质细胞亚定位信号序列的深入分析.方法 以质粒pEGFP-N1为骨架,融合从pGEX-2TK载体中扩增的GST编码序列,构建成pGST-EGFP融合表达质粒;再插入人工合成的已知核定位蛋白SV40的核定位序列(NLS),构建成pGST-EGFP-SV40 NLS作为阳性对照;另外,构建小分子量蛋白TNNI2在pGST-EGFP的融合表达质粒.将对照pEGFP-N1和各重组质粒分别用脂质体介导,瞬时转染HeLa细胞,荧光显微镜下观察蛋白的核定位情况.结果 单独表达的EGFP呈全细胞分布,而GST-EGFP融合蛋白只存在于细胞浆;SV40 NLS能将GST-EGFP融合蛋白带进细胞核.虽然TNNI2-EGFP融合蛋白的细胞亚定位呈现核内丰度更高的特点,但TNNI2-GST-EGFP融合蛋白仅限定于胞浆分布,提示TNNI2不能主动定位到细胞核中.结论 成功构建了蛋白质细胞亚定位示踪载体--pGST-EGFP.作为核定位信号分析系统,其对小分子蛋白细胞亚定位的示踪效果优于传统的pEGFP载体,更适用于科研工作中小分子量蛋白质核定位信号序列的研究.  相似文献   

4.
目的构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)-人乳头瘤病毒16型变异株E7(HPV16-HBE7)重组质粒pEGFP-HBE7,研究HPV16-HBE7蛋白亚细胞定位,为进一步了解其生物学功能奠定基础。方法采用分子克隆技术,将HPV16-HBE7基因克隆在pEGFP—Cl表达载体上,用脂质体法导入宫颈癌细胞中;Western印迹检测HBE7蛋白的表达;同时借助免疫荧光技术和EGFP-融合蛋白技术,采用激光共聚焦显微镜观察HBE7蛋白的亚细胞定位。结果重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定,其目的片段大小、插入位点和核苷酸序列完全正确;结果表明,转染细胞HBE7蛋白的相对表达量其胞浆明显多于胞核;各个时间段HBE7蛋白均以胞浆分布为主,绿色荧光密集点状分布于细胞浆内,而野生株E7(WE7)蛋白分布在核内。结论人乳头瘤病毒16型变异株E7蛋白主要分布在细胞浆内,以胞浆为主的分布可能和HBE7基因发生突变后丢失核定位信号有关。  相似文献   

5.
摘要通过昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达HPV16L1 VLP,纯化鉴定后利用其建立血凝抑制实验,检测HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。利用重组杆状病毒感染悬浮培养的昆虫细胞表达HPV16L1蛋白,大量获得VLP;优化扩增蛋白的条件并用SDS-PAGE分析鉴定;经氯化铯密度梯度离心法纯化VLP;利用所得VLP建立血凝抑制试验,鉴定制备的HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制活性。优化蛋白表达条件结果显示,当重组杆状病毒感染细胞的MOI=10时目的蛋白表达量最大;按此滴度感染悬浮培养的昆虫细胞,收获、纯化VLP并鉴定其特异性;利用所得VLP建立了血凝抑制实验,鉴定HPV16L1单克隆抗体的血凝抑制效价为1∶16。建立的血凝实验,可用于鉴定和检测HPV16L1相关抗体,为HPV诊断试剂的开发提供实验基础。  相似文献   

6.
目的:提高16型人乳头瘤病毒(HPV16)L1基因在杆状病毒昆虫细胞中的表达水平,为研制预防性HPV疫苗奠定基础。方法:根据昆虫细胞密码子偏性对野生型HPV16L1基因进行改造,利用Bac-to-Bac表达系统获得重组杆状病毒,感染昆虫细胞Sf9和High Five。Western blot鉴定表达产物;电镜下观察病毒样颗粒形成。利用ELISA法评价HPV16L1基因的优化效果,探讨L1蛋白表达的最佳条件。结果:在相对分子质量56kDa处出现HPV16L1的特异性条带;电镜下可见病毒样颗粒在昆虫细胞的核内形成;优化型HPV16L1基因的表达水平显著高于野生型。High Five细胞表达的最佳条件为MOI=10,表达时相72h,其L1蛋白表达量至少比Sf9细胞高3倍。结论:密码子优化技术确实能够促进HPV16L1蛋白的高效表达,而High Five细胞表现出的显著优势尤其值得关注。  相似文献   

7.
目的:通过昆虫-杆状病毒表达系统获得人乳头瘤病毒(HPV)16/18/33/58亚型的主要衣壳蛋白L1。方法:克隆了HPV16/18/33/58亚型的L1蛋白基因,并采用密码子优化策略进行改造(记为HPV16/18/33/58亚型mL1),将优化基因片段插入pFastBac Dual载体获得重组载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞后得到重组Bacmid,转染昆虫Sf9细胞,Western印迹和SDS-PAGE检测重组蛋白的表达。结果:获得了表达HPV16/18/33/58亚型mL1蛋白的重组杆状病毒;Western印迹和SDS-PAGE分析表明该重组杆状病毒感染昆虫Sf9细胞后表达mL1蛋白,且mL1蛋白主要分布在细胞中;优化了蛋白表达时间和感染复数,获得目的蛋白mL1的高效表达。结论:多个亚型HPV L1蛋白的克隆表达,为中国优势血清型疫苗的研制奠定了基础。  相似文献   

8.
对虾白斑综合征病毒厦门分离株ORF220编码真核生物GP130受体同源蛋白。将ORF220和绿色荧光蛋白编码基因融合在一起克隆到昆虫杆状病毒表达载体pFastBacI,然后与AcBacmid共同转染DH10B细胞。用PCR鉴定含有ORF220和EGFP基因的重组质粒,提取纯化重组质粒并转染昆虫细胞进行表达。结果发现,DNA转染后3-5d可以在荧光显微镜下观察到绿色荧光,表明融合蛋白在昆虫系统内成功表达。用病毒上清液感染昆虫细胞进行时相观察,结果表明,ORF220蛋白在昆虫细胞的细胞质和细胞核内呈随机分布,没有特异的细胞定位。  相似文献   

9.
为了构建HPV16型晚期蛋白重组杆状病毒,并使其在昆虫细胞中获得高效表达.首先构建2株重组杆状病毒转移质粒,分别携带人乳头瘤病毒晚期基因L1及L1和L2,再用线性化的杆状病毒DNA与该重组杆状病毒转移质粒共转染sf9昆虫细胞进行同源重组,获得2株重组杆状病毒.经鉴定该重组病毒中有目的基因存在且可表达所编码的L1或L2晚期蛋白.结果表明HPV16型晚期蛋白在昆虫细胞中获得成功表达,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研制和诊断试剂的研究开发奠定了基础.  相似文献   

10.
应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达。构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达。由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对:HPV16E7分子生物学特性.致瘤机理及APC提呈等的研究。为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础。  相似文献   

11.
Using the larvae of the silkworm, Bombyx mori, we examined the baculovirus expression vector system for the expression of the enhanced green fluorescence protein (EGFP) gene under the control of several gene promoters in vivo. To investigate the gene-delivery efficiency of the baculovirus into various larval tissues, we constructed two recombinant baculoviruses carrying the EGFP gene downstream of the Drosophila melanogaster hsp70 gene promoter from B. mori nucleopolyhedrovirus (BmNPV) and Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcNPV). After injection of these recombinant baculoviruses into newly ecdysed 5th instar larvae, hsp70::EGFP-BmNPV, but not hsp70::EGFP-AcNPV, caused intense expression of EGFP not only in various non-neural tissues, but also in the neural organs including the brain 5 days postinfection. To investigate the cell-specific expression in the brain, we constructed recombinant C4/B3::EGFP-BmNPV and PTTH::EGFP-BmNPV which carry the EGFP gene under the control of bombyxin B3 and prothoracicotropic hormone (PTTH) gene promoters, respectively. Injection of these recombinant baculoviruses caused specific expression of EGFP with a high gene-expression efficiency in the neurosecretory cells of the brain depending on the neurohormone gene promoters. Present results indicate that this in vivo gene-expression system mediated by the baculovirus can serve as an efficient system permitting gene delivery into neural tissues in insects.  相似文献   

12.
根据编码增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的开放读码框(open reading frame,ORF)设计引物,PCR方法扩增出5'端带His标签的EGF PORF,利用杆状病毒表达系统构建表达EGFP基因的重组杆状病毒DNA分子,转染sf9细胞.取细胞...  相似文献   

13.
由于HPV16E6蛋白能诱导机体保护性免疫反应,可作为基因治疗的靶抗原。用杆状病毒昆虫细胞表达系统制备了HPV16E6基因工程蛋白,拟用于宫颈癌细胞系小鼠模型抗癌的免疫治疗。用PCR技术从HPV16基因组中扩增获得转化基因E6的完整ORF,按TA策略将其克隆到自行制备的杆状病毒转移载体pVL1393T尾载体中,置于杆状病毒AcMNPVPolh晚期启动子控制之下,用此重组转移质粒pVL1393E6与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,经噬斑筛选获得带有编码E6蛋白基因的重组杆状病毒株,并在昆虫细胞Sf9中表达为非融合性E6蛋白。SDSPAGE电泳分析其分子量约为18kD,免疫印迹实验表明,此重组蛋白能被兔抗HPV16E6抗体所识别。  相似文献   

14.
The L1 coat protein of human papillomavirus type 11 (HPV-11) was expressed in Sf-9 insect cells with the recombinant baculovirus vector Ac11L1. Viruslike particles (VLPs) were identified by electron microscopy in the nucleus and cytoplasm of Sf-9 cells infected with Ac11L1. The L1 protein was purified from Ac11L1-infected insect cells. The purified protein spontaneously assembled in vitro into various aggregates, including particles appearing similar to empty virions. Reaction of VLP-containing insect cell extracts with antisera directed against either denatured or nondenatured capsid epitopes in Western blot (immunoblot) and immuno-dot blot assays suggested that conformational epitopes present in native HPV-11 infectious virions were also present on the baculovirus-produced HPV-11 VLPs. Immuno-dot blot assays using human sera obtained from individuals with biopsy-proven condyloma acuminatum correlated closely with results previously obtained in HPV-11 whole virus particle-based enzyme-linked immunosorbent assays. These morphologic and immunologic similarities to native HPV-11 virions suggest that recombinant VLPs produced in the baculovirus system may be useful in seroepidemiology and pathogenesis studies of genital HPV infection and that they may also be potential candidates for vaccine development.  相似文献   

15.
旨在利用杆状病毒系统表达、制备人视黄醇结合蛋白(RBP4)并检测其免疫原性。将人RBP4基因片段及信号肽SS64片段亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-dual(pFBd)中,获得相应的重组转移质粒;转化大肠杆菌菌株DH10bac,转座后经筛选获得重组穿梭质粒rbacmid,将重组穿梭质粒转染孔板培养的Sf9细胞,获得含人RBP4表达框的重组杆状病毒,经过扩增获得毒种。毒种感染对数生长期的Sf9细胞并表达人RBP4蛋白(I-RBP4),通过SDS-PAGE和Western blotting对表达蛋白进行检测和鉴定。用毒种感染悬浮培养的Sf9细胞制备一批RBP4蛋白,完成SDS、Western blotting的检测及少量的多抗制备。纯化重组蛋白并与E.coli重组人RBP4(E-RBP4)分别免疫家兔。实验结果,酶切鉴定及测序证实重组转移质粒构建正确;成功构建重组RBP4-bacmid;人RBP4蛋白在昆虫细胞获得高效表达。表达的RBP4蛋白可以分泌到培养基中,分子量约为23 kDa,经过计算表达量为100 mg/L;纯化蛋白免疫兔子制备了多抗血清,血清滴度为1∶100 000,高于原核表达的抗体滴度(1∶10 000),与人体提纯蛋白制备的抗体滴度相近。杆状病毒系统高效表达了人的RBP4蛋白,具有较好的抗原性,并获得高亲和力的抗血清,为下一步的人血RBP4检测试剂盒的制备打下了坚实的基础。  相似文献   

16.
蛋白激酶D(Protein kinase D,PKD)是一种新的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族和甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)受体,参与细胞内多种生理生化过程。为获得高纯度的PKD1的催化结构域(PKD1-cat)用于晶体学结构的研究,将带有GST标签的PKD1-cat基因克隆到杆状病毒转移载体pFastBac1中,构建了重组质粒。将重组质粒转化到含穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞中,转座后获得了含目的基因GST-PKD1-cat的重组Bacmid。重组Bacmid DNA转染Sf9昆虫细胞后,获得重组杆状病毒并扩毒。将毒种以5 PFU/cell的感染复数感染悬浮培养的T.ni昆虫细胞,SDS-PAGE和Western blotting检测表达产物。结果显示,表达产物在分子量约68 kDa处有一特异条带可与GST单克隆抗体发生反应。经谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析纯化和PreScission Protease切除GST标签后,得到了纯度很高的分子量约42 kDa的目的蛋白PKD1-cat。体外PKD激酶活性实验结果显示,随着PKD1-cat浓度的增加,激酶活性增高。这些结果显示截短的重组PKD1-cat有很高的催化活性和纯度,为采用核磁共振或晶体学方法解析PKD1-cat的三维结构奠定了基础。  相似文献   

17.
To improve the existing human papillomavirus type16 (HPV16) virus-like particle (VLP) preparation, a highly efficient, economical and timesaving system was established. Sf-9 cells were infected with recombinant baculovirus containing the target gene encoding HPV16L1 protein with 6xHis tag, and harvested 72 h postinfection (p.i.) at 27 degrees. The ProBond(TM) purification system was used for protein purification. The molecular weight of expressed HPV16L1 protein was 58 kD as revealed by SDS-PAGE, and confirmed by Western blot. The purity of denatured and native HPVL1 proteins that were prepared were 91.9% and 71.5%, respectively, which corresponded to a yield of 2.26 mg denatured protein and 1.84 mg native protein per 2x10(7) cells. The proteins were further analyzed by mouse erythrocyte hemagglutination assay and hemagglutination inhibition assay, and there effects on VLP formation were also visualized by transmission electron microscopy. Results showed that the native protein purified was biologically active as natural HPVL1 protein, inducing the murine erythrocyte agglutination and VLP formation. In addition, the purified recombinant HPV16L1 native protein with 6xHis tag could self-assemble into virions in vitro. Hopefully, the present expression and purification system is promising to be convenient, timesaving and economical for preparation of HPV16 VLP vaccine.  相似文献   

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