鸡脂肪酸结合蛋白基因的克隆和测序分析

根据哺乳动物脂肪酸结合蛋白基因序列设计一对引物对鸡基因组进行PCR扩增,将163bp扩增片段进行克隆和测序,并与猪的脂肪酸结合蛋白（fatty acid binding protein,FABP）基因序列进行同源性比较。该基因因片段与猪的心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid binding protein,H-FABP）基因有68%的同源性,与猪的脂肪型脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty acid binding protein,A-FABP）基因有75%的同源性,演绎成氨基酸之后与猪的脂肪型脂肪酸结合蛋白相应的氨基酸有75%的同源性。Northern结果表明该基因只在脂肪组织中表达。     

焦磷酸测序技术在禽流感病毒金刚烷胺耐药性检测中的应用

流感病毒M2蛋白五个关键位点氨基酸残基(第26、27、30、31和34位)中的任何一个发生突变都会导致抗流感病毒药物中金刚烷胺抗药性的产生。本研究利用焦磷酸测序技术对94株不同亚型禽流感病毒金刚烷胺耐药性分子决定区进行了鉴定,并进行抗药性分析。结果表明94株禽流感病毒中有81株M2基因存在金刚烷胺耐药性的分子标签,其余的13株根据分子标签判断为对金刚烷胺敏感。耐药性的分子标记存在V27I和S31N两种突变形式,其中绝大多数为S31N。     

腾冲嗜热菌单链 DNA 结合蛋白 SSB2 和 SSB3 新的单链 DNA 结合特性

摘要：【目的】揭示腾冲嗜热菌中两个单链DNA结合蛋白SSB2和SSB3的全新的底物结合功能及其不同的体内表达模式。【方法】利用腾冲嗜热菌复制起始位点附近的长度较短的单链DNA为底物,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及western blot方法,研究SSB2和SSB3体外单链DNA结合特征和体内表达模式。【结果】SSB2 与35nt的复制起始区单链DNA（ssDNA）结合, 形成单个SSB2-DNA复合物;当与59 nt ssDNA结合时,可以随着蛋白浓度的递增形成一个或两个SSB2-DNA复合物;而与70n     

基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在精准医疗中的应用研究进展

基因突变检测在肿瘤等疾病的早期诊断、个体化给药指导、疾病治疗进程与耐药监控等方面具有极其重要的意义。随着测序技术的不断发展,DNA 突变的检测与分析已为病毒感染、血液病和实体瘤等疾病的个体化诊治提供重要参考。焦磷酸测序技术是一种基于生物发光法测定焦磷酸盐的实时 DNA 测序技术,其用于 DNA 序列分析时不需电泳和荧光标记,定量性能好,结果准确,易于实现自动化,在基因突变检测分析与肿瘤等疾病诊治中发挥巨大作用。综述基于焦磷酸测序技术的基因突变检测在分子靶向个体化治疗和疾病诊断中的应用研究进展。     

胆汁三烯结合蛋白在大肠杆菌中的表达、复性与纯化

目的：合成胆汁三烯结合蛋白（BBP）基因并在大肠杆菌中表达,获得重组BBP纯化制品。方法：根据天然BBP的基因序列和大肠杆菌偏好密码子设计并合成BBP基因的引物,PCR扩增优化的BBP基因序列,克隆至载体pEasy-T3;测序正确后,将该序列克隆至表达载体pET-32a上,构建表达质粒,转化至大肠杆菌BL21（DE3）pLysS,在IPTG诱导下表达融合蛋白;采用Ni柱纯化融合蛋白。结果：PCR扩增获得了优化后的BBP基因序列,构建了表达载体pET-32a-BBP;SDS-PAGE分析表明表达的融合蛋白相对分子质量为20×10^3,以包涵体形式存在,占全菌蛋白的40%以上;变性、复性后经Ni2＋柱纯化,获得纯度达98%以上的重组蛋白。结论：优化并合成了BBP全基因序列,获得了高纯度重组融合蛋白,为进一步鉴定其生物活性及筛选小分子的研究奠定了基础。     

一个未知的特异结合雌激素效应元件编码链的单链结合蛋白

本文介绍一个不是雌激素受体（ＥＲ）却能专一地结合雌激素效应元件（ＥＲＥ）编码单链的单链结合蛋白,对此蛋白在细胞中的定位、组织中的分布、热稳定性、同二价金属离子的关系作一初步研究。发现其受雌激素负调控。此蛋白在人病理样品２９例乳癌中同ＥＲ的含量似有一定的负相关关系,讨论了上述结果的意义。     

新型大肠杆菌裂解系统在重组蛋白回收中的应用

溶菌酶通过降解细菌细胞壁的肽聚糖裂解细菌,利用此特性,构建温度敏感的内源裂解系统,达到高效释放和回收重组蛋白的目的。构建了温度敏感的Ｔ４溶菌酶基因表达质粒ｐＳＣ－ｌｙｓ（ｐＳＣ１０１复制子）和ｐ１５Ａ－ｌｙｓ（ｐ１５Ａ复制子）,质粒与工程菌构成了新型内源裂解系统,系统可以与高拷贝复制子（如ｐＭＢ１,ＣｏｌＥ１）的重组蛋白表达擀粒兼容。结果表明,裂解系统的量适裂解条件由三个要素构成：ｐＳＣ－ｌｙｓ－     

人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体-尿激酶融合蛋白在大肠杆菌中的功能性表达

尿激酶是目前临床上广泛使用的一种有效的溶栓制剂 ,但由于尿激酶缺乏对血栓的特异亲和性 ,导致临床上尿激酶的使用剂量较大 ,容易出现全身性出血等副作用。因而开发对血栓特异的导向溶栓制剂是目前溶栓药研制的一个重要方向。本实验室在以前的工作中 ,利用噬菌体表面呈现技术 ,筛选到一种对人纤维蛋白特异的鼠单链抗体[1 ] ,在对该鼠抗体可变区进行结构模建的基础上[2 ] ,对其进行了人源化改造和体外亲和力成熟 ,得到亲和力和特异性较鼠抗体更好的人源化单链抗体[3 ] 。为研制导向溶栓制剂 ,本实验室构建了人源化单链抗体 低分子量尿激酶的…     

重组人ZP3蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的:用基因工程方法制备重组人ZP3蛋白。方法:以全长人ZP3 cDNA片段为模板,通过PCR扩增出编码人ZP3蛋白不同肽段的cDNA片段,然后将这些cDNA片段分别插入到表达载体pET-19b的NcoⅠ-BamHⅠ或NdeⅠ-BamHⅠ位点内,共构建成6种人ZP3蛋白非融合表达质粒(pEZP3-1~pEZP3-6)和3种人ZP3蛋白融合表达质粒(pEZP3-7~pEZP3-9)。将这9种表达质粒分别转化大肠杆菌Rosetta2(DE3)感受态细胞并选择出Apr转化子,将Apr转化子接种到NZCYM培养基中(含AP 100μg/mL),在35~37℃振荡培养到对数生长期,加入IPTG至1.0~1.5mmol/L浓度诱导培养3h,离心收集细胞进行SDS-PAGE电泳检测和Western Blot杂交分析。结果:这9种人ZP3蛋白表达质粒在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中得到高效表达,目的蛋白占总细胞蛋白的10~25%,表达产物均以包涵体形式存在。结论:成功构建了重组人ZP3蛋白原核表达系统,为进一步研究和应用人ZP3蛋白打下了基础。     

Mechanistic Basis of Plasmid-Specific DNA Binding of the F Plasmid Regulatory Protein,TraM

The conjugative transfer of bacterial F plasmids relies on TraM, a plasmid-encoded protein that recognizes multiple DNA sites to recruit the plasmid to the conjugative pore. In spite of the high degree of amino acid sequence conservation between TraM proteins, many of these proteins have markedly different DNA binding specificities that ensure the selective recruitment of a plasmid to its cognate pore. Here we present the structure of F TraM RHH (ribbon–helix–helix) domain bound to its sbmA site. The structure indicates that a pair of TraM tetramers cooperatively binds an underwound sbmA site containing 12 base pairs per turn. The sbmA is composed of 4 copies of a 5-base-pair motif, each of which is recognized by an RHH domain. The structure reveals that a single conservative amino acid difference in the RHH β-ribbon between F and pED208 TraM changes its specificity for its cognate 5-base-pair sequence motif. Specificity is also dictated by the positioning of 2-base-pair spacer elements within sbmA; in F sbmA, the spacers are positioned between motifs 1 and 2 and between motifs 3 and 4, whereas in pED208 sbmA, there is a single spacer between motifs 2 and 3. We also demonstrate that a pair of F TraM tetramers can cooperatively bind its sbmC site with an affinity similar to that of sbmA in spite of a lack of sequence similarity between these DNA elements. These results provide a basis for the prediction of the DNA binding properties of the family of TraM proteins.     

球孢白僵菌转录因子BbMSN2与其结合基序变体的结合特性分析

球孢白僵菌是一种广谱性杀虫真菌,为了探索其转录因子BbMSN2识别启动子核心序列的能力,本研究外源表达并纯化了BbMSN2蛋白,合成了3个含有不同数量核心序列(AGGGG/ CCCCT)的核酸探针和6个核心序列点突变的核酸探针,将BbMSN2蛋白和核酸探针体外结合,通过凝胶迁移实验检测核酸探针及结合蛋白的迁移情况。研究发现,目的蛋白与含有核心序列的核酸探针结合时,核酸探针发生了凝胶迁移现象,其中核心序列数量对凝胶迁移的协同效益不显著。但目的蛋白与核心序列点突变核酸探针结合时,凝胶迁移现象明显减弱。上述结果表明,转录因子BbMSN2可以和含有核心序列核酸探针结合并发生相互作用,且对识别序列具有很强的特异性。本研究为深入探索BbMSN2转录调控机制奠定了试验基础。     

改造地高辛标记DNA和检测试剂盒用于凝胶阻滞实验的新方法

凝胶阻滞实验（gel retardation）,又称为电泳迁移率变动实验（Electrophoretic mobility shift assay,EMSA）,是研究蛋白和DNA相互作用的一种技术。传统的³²P标记探针的凝胶阻滞实验,具有很高的灵敏度,然而也有接触危险性的放射性同位素且不容易定量分析的缺点。最近利用非放射性标记的凝胶阻滞实验,已有很多成功的报导,该方法快捷,安全,灵活,但非放射性标记探针的凝胶阻滞试剂盒的费用却很高。在论文中,我们提供了一种改造地高辛标记DNA和检测试剂盒用于凝胶阻滞实验的新方法。首先将双链DNA探针末端引入EcoRI 粘性末端以便进行3′末端标记,然后利用价格比较便宜的地高辛标记DNA和检测试剂盒(DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II, Rohe) 进行探针标记和凝胶阻滞信号检测。经过多次实验参数的摸索,最终得到了成功的结果,为利用地高辛标记DNA和检测试剂盒进行凝胶阻滞实验提供了成功的例子和方法。     

肿瘤细胞中端粒酶催化亚基hTERT基因启动子结合因子的检测

为了研究端粒酶催化亚基ｈＴＥＲＴ基因在癌变细胞中组成型表达的调控机制,采用凝胶阻滞电泳（ＥＭＳＡ）实验方法检测人粒系白血病细胞ＨＬ－６０、人红系白血病细胞Ｋ５６２、人肺癌细胞Ａ５４９、人肝癌细胞ＨｅｐＧ２及正常人肺成纤维细胞２ＢＳ等体外传代的肿瘤和正常二倍体细胞核提取物中与ｈＴＥＲＴ启动子核心序列结合的核因子活性。结果在４种实验肿瘤细胞中均可检测出与ｈＴＥＲＴ基因启动子结合的核因子活性,而正常二倍     

A Single-Amino-Acid Substitution in the C Terminus of PhoP Determines DNA-Binding Specificity of the Virulence-Associated Response Regulator from Mycobacterium tuberculosis

The Mycobacterium tuberculosis PhoP-PhoR two-component system is essential for virulence in animal models of tuberculosis. Genetic and biochemical studies indicate that PhoP regulates the expression of more than 110 genes in M. tuberculosis. The C-terminal effector domain of PhoP exhibits a winged helix-turn-helix motif with the molecular surfaces around the recognition helix (α8) displaying strong positive electrostatic potential, suggesting its role in DNA binding and nucleotide sequence recognition. Here, the relative importance of interfacial α8-DNA contacts has been tested through rational mutagenesis coupled with in vitro binding-affinity studies. Most PhoP mutants, each with a potential DNA contacting residue replaced with Ala, had significantly reduced DNA binding affinity. However, substitution of nonconserved Glu215 had a major effect on the specificity of recognition. Although lack of specificity does not necessarily correlate with gross change in the overall DNA binding properties of PhoP, structural superposition of the PhoP C-domain on the Escherichia coli PhoB C-domain-DNA complex suggests a base-specific interaction between Glu215 of PhoP and the ninth base of the DR1 repeat motif. Biochemical experiments corroborate these results, showing that DNA recognition specificity can be altered by as little as a single residue change of the protein or a single base change of the DNA. The results have implications for the mechanism of sequence-specific DNA binding by PhoP.     

通过荧光标记的凝胶阻滞技术分析Opaque2蛋白与ZmGRAS11启动子的结合位点

凝胶阻滞实验（electrophoretic mobility shift assay,EMSA）是研究蛋白质与核酸结合的一种关键实验技术。EMSA技术兴起以来,使用放射性同位素、生物素标记核酸探针的手段已经非常成熟,但这两种传统的标记技术分别具有放射性探针稳定性差和生物素检测步骤复杂等缺点。近年来,尽管荧光标记探针逐渐被应用于EMSA中,但是对于利用荧光标记探针的EMSA仍缺乏系统的报道。对荧光标记的EMSA技术流程进行了优化和系统总结;利用6-羧基荧光素（6-carboxy-fluoroscine,FAM）标记ZmGRAS11启动子探针,通过EMSA检测其与Opaque2蛋白的结合,明确了蛋白和探针的适宜比例为8∶1。对GCN4 motif序列碱基进行突变并利用EMSA分析Opaque2与ZmGRAS11启动子之间的结合位点,结果表明GCN4 motif的“TGAC”核心基序在ZmGRAS11启动子与Opaque2蛋白的结合中可能起到了关键作用。研究结果为进一步探究Opaque2-ZmGRAS11转录调控模块在玉米籽粒发育中的作用机理提供了数据支撑。     

Identification of trans-acting factors regulating SamDC expression in Oryza sativa

Abiotic stress affects the growth and productivity of crop plants; to cope with the adverse environmental conditions, plants have developed efficient defense machinery comprising of antioxidants like phenolics and flavonoids, and osmolytes like polyamines. SamDC is a key enzyme in the polyamine biosynthesis pathway in plants. In our present communication we have done in silico analysis of the promoter region of SamDC to look for the presence of different cis-regulatory elements contributing to its expression. Based on the presence of different cis-regulatory elements we completed comparative analysis of SamDC gene expression in rice lamina of IR-29 and Nonabokra by qPCR in response to the abiotic stress treatments of salinity, drought, cold and the biotic stress treatments of ABA and light. Additionally, to explore the role of the cis-regulatory elements in regulating the expression of SamDC gene in plants we comparatively analyzed the binding of rice nuclear proteins prepared from IR-29 and Nonabokra undergoing various stress treatments. The intensity of the complex formed was low and inducible in IR-29 in contrast to Nonabokra. Southwestern blot analysis helped in predicting the size of the trans-acting factors binding to these cis-elements. To our knowledge this is the first report on the comprehensive analysis of SamDC gene expression in rice and identification of the trans-acting factors regulating its expression.     

Zif268的锌指DNA结合区在大肠杆菌中的功能性表达

锌指蛋白是最大的蛋白家族,是识别核酸最常见的、最有效的结构元件。通过选择合适的表达载体及诱导表达条件,实现了小鼠转录因子Zif268的锌指DNA结合区在大肠杆菌中的部分可溶性表达。凝胶迁移率移动试验证实纯化的可溶部分锌指DNA结合区可以特异性识别、结合其天然靶序列,提示锌指DNA结合区在大肠杆菌中得到了功能性表达。锌指DNA结合区在大肠杆菌中的功能性表达成功为锌指蛋白DNA相互作用的胞内遗传筛选模型的建立奠定了基础。