重组枯草芽孢杆菌发酵廉价原料生产普鲁兰酶

[目的]构建长野芽孢杆菌普鲁兰酶突变体枯草芽孢杆菌工程菌株,优化发酵条件,筛选廉价的培养基原料生产普鲁兰酶。[方法]利用分子生物学手段,将基因pul324和表达载体p WB980连接,构建表达质粒p WB-pul324并转化Bacillus subtilis WB600;对表达产物进行SDS-PAGE分析和初始酶活的测定。进一步优化发酵条件,对不同碳源和氮源进行发酵培养基的筛选,同时研究不同金属离子的添加和培养基初始p H、接种量对发酵产酶的影响。[结果]获得基因工程菌B.subtilis WB600/p WB-pul324,SDS-PAGE电泳结果显示在89 k Da处有特异性条带,发酵初始酶活为12.34 U/ml;筛选得到玉米淀粉水解液和玉米浆干粉为培养基最适碳源和氮源,其最适浓度分别为50 g/L和30 g/L。Mn~(2+)、Fe~(3+)、Fe~(2+)和Tween-80的添加能提高发酵产酶活力。在最适初始p H 6.5,以最适5%接种量接种于优化后的培养基中,摇瓶发酵80 h普鲁兰酶的酶活达到414.48 U/ml。[结论]实现了普鲁兰酶突变体在枯草芽孢杆菌中的高效表达,筛选获得的培养基主要原料经济低廉,经过发酵条件优化后,重组菌酶活达到414.48 U/ml,是之前研究结果(20.16U/ml)的20倍。     

植物乳杆菌ZJ316生产细菌素

[目的]研究植物乳杆菌ZJ316生长和产细菌素的最佳培养基成分和发酵条件,以提高该菌产plantaricin ZJ316的能力.[方法]改变培养基成份和发酵条件,考察不同氮源、碳源等培养基成分和不同的发酵温度等条件对ZJ316生长和产细菌素的影响.[结果]最佳培养基为MRS培养基;优化后的培养基配方为葡萄糖10 g/L,麦芽糖10 g/L,酵母提取物10 g/L,蛋白胨10 g/L,柠檬酸三铵2 g/L,吐温80为1 Ml/L,K2HPO4·3H2O 6 g/L,乙酸钠5 g/L,硫酸镁0.2 g/L,硫酸锰0.05 g/L.培养基初始Ph6.5,30℃静置培养24 h.[结论]通过培养基成分和发酵条件的优化,细菌素产量提高了2.3倍,为进一步研究和规模化生产奠定基础.     

淫羊藿提取物对酵母朊病毒［PSI+］治愈的影响

研究6种菊科中药对酵母朊病毒[PSI^＋]治愈效果。通过在培养基内加入适量浓度中药成分的方式,利用表型检测方法在细胞水平上检测中药对酵母朊病毒的治愈。淫羊藿醇提物对朊病毒[PSI^＋]最佳治愈浓度为0．0975g/mL,治愈率可达到3％,而水提物没有治愈作用。淫羊藿醇提物对酵母朊病毒有一定的治愈作用。     

可同化阿拉伯糖的木糖还原酿酒酵母菌株构建

[目的] 以秸秆等木质纤维素类生物质为原料生产液体生物燃料乙醇,目前生产成本高,大规模工业化生产尚有较大难度。构建能同化阿拉伯糖进行木糖还原生产木糖醇的重组酿酒酵母菌株,以实现原料中全糖利用、生产高附加值产品,实现产品多元化。[方法] 首先,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术依次向出发菌株中导入阿拉伯糖代谢途径和木糖还原酶基因,使菌株获得代谢阿拉伯糖和将木糖转化为木糖醇的能力;其次,通过适应性驯化的进化工程手段,提高重组菌株对阿拉伯糖的利用效率;最后,通过混合糖发酵验证重组菌株利用阿拉伯糖和还原木糖产木糖醇的能力。[结果] 通过导入植物乳杆菌的阿拉伯糖代谢途径,酿酒酵母菌株获得了较好的利用阿拉伯糖生长繁殖的能力;进一步导入假丝酵母的木糖还原酶基因后,重组菌株在葡萄糖作为辅助碳源条件下可高效还原木糖产木糖醇,但阿拉伯糖的利用能力下降。利用以阿拉伯糖为唯一碳源的培养基进行反复批次驯化,阿拉伯糖的利用能力得以恢复和提升,得到表型较好的重组菌株KAX3-2。该菌株在木糖（50 g/L）和阿拉伯糖（20 g/L）混合糖发酵条件下发酵72 h时,对阿拉伯糖和木糖利用率分别达到42.1%和65.9%,木糖醇的收率为64%。[结论] 本研究成功构建了一株能有效利用阿拉伯糖并能将木糖转化为木糖醇的重组酿酒酵母菌株KAX3-2,为后续构建、获得阿拉伯糖代谢能力更强、木糖醇积累效率更高菌株的工作奠定了基础。     

真菌在中药成分转化中的应用

对真菌在中药成分生物转化中的应用取得的进展进行了综述,介绍了真菌的生物转化方法和研究现状。利用真菌对中药成分进行转化是中药高效利用的一条新思路,可显著推动我国的中药资源的高效开发与利用,有利于在短时间内研制出具有自主知识产权的新药。     

1,3-丙二醇产生茵基因组重排育种

[目的]本文以肺炎克雷伯氏杆菌为研究对象,利用基因组重排技术,提高其对发酵体系中主要产物的耐受性,获得1,3-丙二醇高产菌.[方法]以含预处理后的出发菌株的补料发酵终点液的96孔板为筛选方法,利用基因组重排技术育种.[结果]筛选到的5株高产菌株(LSG1,LSG2,LSG4,LSG5,LSG6),在3升罐批次发酵中的1...     

L-色氨酸基因工程菌发酵培养基配方优化研究

[目的]对L-色氨酸基因工程菌液态发酵的培养基进行优化。[方法]通过P-B试验,筛选出对基础发酵培养基的发酵液中L-色氨酸浓度影响显著的因素,进一步通过最陡爬坡试验、B-B试验对影响显著的因素进行优化。在此基础上,确定最佳的发酵培养基配方。[结果]酵母粉、Fe SO4·7H2O、KH2PO4对发酵液中L-色氨酸浓度的影响显著;最佳培养基配方为:Glucose 25.0 g/L,酵母粉4.5 g/L,(NH4)2SO49.0 g/L,Mg SO44.5 g/L,柠檬酸钠2.0 g/L,Fe SO4·7H2O 96.1 m g/L,KH2PO41.2 g/L。[结论]根据此配方进行验证实验,发酵液中L-色氨酸浓度可达2.25 g/L。     

基因重组构建甘蔗糖蜜酒精高产酿酒酵母菌株

[目的]增强工业用酿酒酵母菌株对甘蔗糖蜜中非还原糖的利用,提高糖蜜发酵乙醇产率。[方法]构建载体p YX212-agl3,分别在载体的TPI启动子和终止子5’端加上10 bp的酵母转座子重复序列,PCR扩增获得TPIP-agl3-TPIT片段,将该片段电转化至工业用野生型酿酒酵母MF1001的单倍体细胞中,复倍后经过YPR培养基初筛和YPSR培养基复筛。[结果]获得的MFA1001-3菌株分别在10锤、20锤、30锤和40锤的甘蔗糖蜜培养基中细胞的生长速率、酒精发酵浓度、对糖分的利用能力均有所增强,在40锤糖蜜中的差异最为明显,最大细胞数增加了58.7%,最大产酒率提高了4.5%,发酵结束后醪液中的总糖浓度减少了23.6%,还原糖浓度增加了15.05%。[结论]与出发菌株相比重组菌株发酵醪液中最终还原糖浓度增加而总糖浓度却减少,说明用该方法整合表达α-半乳糖苷酶的重组菌株确实有效地水解了糖蜜中的部分非还原糖同时提高了对总糖的利用率。     

灵芝胞外多糖的分离纯化及生物活性

目前,灵芝多糖的抗肿瘤及免疫活性已得到人们的广泛关注[1]。灵芝子实体多糖和发酵过程中产生的胞内和胞外多糖已被国内外的研究者证实都是有效多糖[2]。因此利用深层发酵来大规模地生产生物活性多糖是目前灵芝开发利用技术的热点。国内对灵芝培养基的组成、培养方法等已?..     

响应面法优化细菌MY07产IAA液体发酵培养基

[目的]研究氮源、氮源和矿质元素对菌株MY07产吲哚乙酸量的影响。[方法]在单因素筛选和初始浓度确定试验的基础上,利用响应面分析法对细菌MY07产吲哚乙酸的液体发酵培养基进行优化,采用Box-Benhnken设计和响应面法对碳源、氮源和矿质元素水平进行分析。[结果]结果表明,菌株MY07产IAA的液体发酵培养基最佳组合为:0.94%甘露醇,2.35%KNO3,0.12‰Mg SO4·7H2O,0.13‰Ca Cl2·2H2O,在此条件下的验证试验表明,IAA产量可达到28.16μg/ml。[结论]通过响应面法优化菌株培养基后,有利于提高该菌产生IAA的能力。     

几种昆虫水提和醇提物对灵芝深层发酵生产多糖的影响

研究了几种昆虫的水提物和醇提物对灵芝深层发酵生产菌体和多糖的影响。结果表明,松毛虫水提物在剂量为30mg/L时,能促进灵芝菌体的生长,生物量从15.23±0.53g/L提高到16.26±0.67g/L。其它昆虫提取物对灵芝菌体的生长无显著影响,其中斑蝥提取物表现出明显的抑制作用。对灵芝多糖产量的影响试验表明,蜣螂水提物在剂量为50mg/L时,能显著提高灵芝胞内多糖的产量,产值从1.93±0.09g/L提高到2.34±0.13g/L;地鳖虫醇提物在剂量为55mg/L,以及松毛虫醇提物在剂量为35mg/L时,对胞内多糖的生产也具有促进作用。此外,蜣螂醇提物在剂量为20mg/L时,对胞外多糖的生产具有促进作用,产量从520.3±20.2g/L提高到589.5±24.1mg/L。结果提示药用昆虫中含有促进灵芝多糖生物合成的功能因子。     

不同植物药提取物对灵芝细胞生长和胞内三萜产物形成的影响

研究了不同植物药的水提和醇提物对灵芝深层发酵过程中菌丝量和胞内三萜产量的影响。将不同植物药的水提物和醇提物分别加入到发酵基础培养基中,培养7d后检测灵芝生物量和胞内三萜含量。结果表明,金银花和枸杞子水提物添加浓度为100mg/L时,可促进灵芝细胞的生长（p＜0.05）。连翘水提物对灵芝生长和胞内三萜的形成都有显著促进作用,当连翘水提物浓度为400mg/L时,胞内三萜产量从对照的（192.54±8.99）mg/L提高到（302.52±3.79）mg/L。金银花和枸杞子醇提物浓度为200mg/L时能显著促进灵芝细胞生长;枸杞子醇提物在同样浓度下还能促进灵芝胞内三萜的形成。但板蓝根和银杏叶水提物和醇提物都对灵芝的细胞生长和胞内三萜形成有较强的抑制作用。     

冬虫夏草与韩芝液体发酵混合培养特性研究

平板培养基上比较了冬虫夏草、韩芝及树舌的菌丝生长速度和对淀粉的利用情况,结果显示三者的生长速度分别达到1.28、0.64和0.55 cm/d,且韩芝与树舌对淀粉的利用均优于冬虫夏草;混合培养结果得出菌种的最佳菌龄比为虫草:韩芝=3 d:5 d,最佳的接种比例为2:3;正交试验混合发酵最佳的培养基配方(%):葡萄糖1.0、淀粉2.0、黄豆粉2.0、酵母粉0.5,在此条件下,菌丝生物量达到最大值1.97 g/100 mL。     

27味中药醇提物对酪氨酸酶体外活性的影响

以儿茶酚为底物,体外分光光度法研究了22个科的27味中药醇提物对酪氨酸酶的抑制活性。结果表明,在各种中药的50%乙醇(v/v)提取液中,生药质量浓度达到2 mg/mL时,红花(Carthamus tinctoriusL.)、杨梅叶(Myrica rubraS.)、黄芩(Scutellaria baicalensisG.)和绿茶(Camellia sinensisL.)相对L-抗坏血酸(维生素C)的酪氨酸酶抑制率分别达到128.62%、83.64%、79.65%和66.48%,它们在美白化妆品领域有潜在的应用价值。     

A comparative study on the production of exopolysaccharides between two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis in submerged mycelial cultures

AIMS: The present study comparatively investigates the optimal culture conditions for the production of exopolysaccharides (EPS) and cordycepin during submerged mycelial culture of two entomopathogenic fungi Cordyceps militaris and Cordyceps sinensis. METHODS AND RESULTS: Fermentations were performed in flasks and in 5-l stirred-tank fermenters. In the case of C. militaris, the highest mycelial biomass (22.9 g l(-1)) and EPS production (5 g l(-1)) were achieved in a medium of 40 g l(-1) sucrose, 5 g l(-1) corn steep powder at 30 degrees C, and an initial pH 8.0. The optimum culture conditions for C. sinensis was shown to be (in g l(-1)) 20 sucrose, 25 corn steep powder, 0.78 CaCl2, 1.73 MgSO4.7H2O at 20 degrees C, and an initial pH 4.0, where the maximum mycelial biomass and EPS were 20.9 and 4.1 g l(-1) respectively. Cordycepin, another bioactive metabolite, was excreted at low levels during the early fermentation period (maximum 38.8 mg l(-1) in C. militaris; 18.2 mg l(-1) in C. sinensis). CONCLUSIONS: The two fungi showed different nutritional and environmental requirements in their submerged cultures. Overall, the concentrations of mycelial biomass, EPS and cordycepin achieved in submerged culture of C. militaris were higher than those of C. sinensis. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: C. militaris and C. sinensis are representative insect-born fungi which have been longstanding and widely used as traditional medicines in eastern Asia. Comparative studies between two fungi are currently not available and this is the first report on the optimum medium composition for submerged culture of C. sinensis.     

Enhanced Production of Ganoderic Acids and Cytotoxicity of Ganoderma lucidum Using Solid-Medium Culture

Submerged cultures of Ganoderma lucidum are used to produce fungal mycelium, which is used as a functional food and in the production of various triterpenoids, including ganoderic acids (GAs). Specific culture approaches that produce fungal mycelium with high levels of GAs and good biological activity are critical in the functional food industry. In this study, a solid-medium culture approach to producing mycelium was compared to the submerged culture system. Production of GAs, biomass, intracellular polysaccharides, and cytotoxicity of the cultured mycelium were compared as between solid and submerged culture. Growing G. lucidum strains on solid potato dextrose agar medium increased biomass, the production of ganoderic acid 24 (lanosta-7,9(11), 24-trien-3α-o1-26-oic acid), GAs, and total intracellular polysaccharides as compared to fungi grown in submerged culture. Triterpenoid-enriched methanol extracts of mycelium from solid-medium culture showed higher cytotoxicity than those from submerged culture. The IC(50) values of methanol extracts from solid-medium culture were 11.5, 8.6, and 9.9 times less than submerged culture on human lung cancer cells CH27, melanoma cells M21, and oral cancer cells HSC-3 respectively. The squalene synthase and lanosterol synthase coding genes had higher expression on the culture of solid potato dextrose medium. This is the first report that solid-medium culture is able to increase GA production significantly as compared to submerged culture and, in the process, produces much higher biological activity. This indicates that it may be possible to enhance the production of GAs by implementing mycelium culture on solid medium.     

不同灵芝菌株菌丝体乙醇提取物体外抑瘤活性的比较和机理

以人急性早幼粒白血病细胞HL-60细胞株作为模型,用MTT法测定生长抑制率,流式细胞Annexin Ⅴ实验和DNA含量法研究抑瘤机制,比较了8个灵芝Ganoderma lucidum菌株发酵菌丝体乙醇提取物的体外抗肿瘤活性和抑瘤机制。筛选结果得到了能产生高抑瘤活性乙醇提取物的灵芝菌株L5。其对HL-60细胞的抑制率为91.4±0.9%(72小时,125μg/mL); 作用48小时后,13.3%的细胞发生早期凋亡,G0/G1期细胞比例比对照组增加15.9%,而S期细胞比例则下降了8.4%,G2/M期细胞数减少7.6%。本研究证明了灵芝菌丝体乙醇提取物能有效抑制HL-60肿瘤细胞的体外生长,抑制率与菌株相关,其抑瘤机制与细胞G0/G1期阻滞和诱导凋亡有关。     

不同因子对山药愈伤组织诱导的影响

研究了基因型、外植体、植物激素和光暗等因子对山药愈伤组织诱导的影响。结果表明 :(1)不同基因型山药均能诱导形成愈伤组织 ,但出愈率不同 ,其排列顺序是 :“4 7号”山药 >铁棍山药 >太谷山药。 (2 )不同外植体在同一种培养基上的诱导率存在差异。同一外植体在不同植物激素浓度配比中 ,诱导率也不同。叶片、茎段、零余子的最佳激素配比均为 6 - BA2 (mg/ L,以下单位同 ) +NAA2 ,诱导率分别为 53.3%、 6 5.6 %、 10 0 % ,茎尖的最佳激素配比为 6 - BA2 +NAA0 .2 ,诱导率为 93.3%。 (3)植物激素在愈伤组织诱导过程中起关键的作用。细胞分裂素与生长素组合使用优于单一激素。二者的浓度配比不同 ,出愈率也不同。 (4 )光暗条件对不同外植体愈伤组织诱导的影响不同。暗培养有利于零余子的诱导 ,而光培养则有利于叶片的诱导。     

Assessment of membrane protection by traditional Chinese medicines using a flow cytometric technique: preliminary findings

In this preliminary study, we used a 'living cell' flow-cytometric approach to membrane protection by four traditional Chinese medicines (TCMs). Cells were incubated, separately, for 30 min with aqueous extracts (1.5% w/v) of lingzhi (Ganoderma lucidum), ginger (Zingiber officianale), ginseng (Panax ginseng), and green tea (Camellia sinensis). Membranes were labelled with a fluorescent probe, cells were then incubated with cumene hydroperoxide, and site-specific oxidation induced by iron/ascorbate. Oxidation of membrane lipids quenches fluorescence. Forward-scatter fluorescence was measured at timed intervals after initiation of oxidation. Results indicate that lingzhi and ginger contain antioxidant component(s) that act within the cell membrane and slow lipid peroxidation in situ. Results demonstrate also that this living cell model is a useful biomonitoring tool to help determine molecular aspects of putative health effects of TCMs.