人SmD1抗原的酵母真核表达及其初步应用

通过PCR扩增Sm D1基因, 与酵母表达载体pPIC9k重组, 构建表达质粒pPIC9k-Sm D1。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168, 在MD平板上筛选重组克隆, 用G418快速筛选高拷贝转化子, 阳性克隆经甲醇诱导表达后, 培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫酶斑点法(immunodot)鉴定。结果显示PCR产物约为360 bp, 符合预期, pPIC9k-Sm D1重组阳性克隆双酶切鉴定正确,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。表达产物Sm D1的分子量约16 kD, 高拷贝毕赤酵母转化菌的表达水平明显高于低拷贝的。immunodot证实表达产物具有天然Sm D1分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。Immunodot的敏感性为96%, 特异性为100%, 与免疫印迹法(immunoblot, IBT)的符合率为98%。Sm D1在巴斯德毕赤酵母中获得高效分泌表达, 为下一步研究打下了基础。     

人自身抗原SSA52的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立

人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题。通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法。采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SSA52。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究。结果显示,RT-PCR产物约为1 400 bp,与预期1 428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52的相对分子质量约52 kD。Western blot法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。DIGFA与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2%(120/126),阴性符合率为94.0%(47/50),总符合率为94.9%(167/176);两种方法检测结果无统计学显著差异(P>0.05)。说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确。     

抗菌肽牛乳铁多肽素（LfcinB）在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母(Pichia pastors)系统表达抗菌肽——牛乳铁多肽素(bovine lactoferricin,简称Lf-cinB),获得的分泌型表达产物具有较强的抗菌活性。首先将人工合成的LfcinB基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinB通过限制性内切酶SalⅠ酶切线性化,经电穿孔法转化入毕赤酵母细胞SMD1168内。G418抗性筛选,得到高拷贝转化子,经PCR检测LfcinB基因与毕赤酵母染色体稳定整合。阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinB。结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽素基因已经整合到酵母细胞基因组中并获得表达,表达产物具有较强的杀菌作用。     

丙型肝炎病毒核心蛋白基因在毕赤酵母中克隆与分析

目的:克隆丙型肝炎病毒核心蛋白基因及其上游DNA序列,为此基因的表达研究作准备。方法:用反转录和PCR方法从HCV的总RNA中扩增得到核心蛋白基因及其上游DNA序列,连接到pMD18-T载体上,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒,测序证明正确后,再将目的基因在毕赤酵母中进行克隆,鉴定。结果:重组质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论:应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HCV核心蛋白基因。     

抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽在毕赤酵母中的表达及活性鉴定

利用巴斯德毕赤酵母系统表达抗菌肽牛乳铁蛋白肽衍生肽简称LfcinBD,获得的表达产物具有较强的抗菌活性.将人工设计的用化学合成法合成的以酵母偏爱密码子编码的LfcinBD基因片段克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中,获得的重组质粒pPIC9K-LfcinBD通过限制性内切酶Sac Ⅰ酶切线性化,电击法转化毕赤酵母GS115宿主菌,G418抗性筛选,得到高拷贝转化子.经PCR检测,LfcinBD基因与毕赤酵母染色体稳定整合.阳性克隆经甲醇诱导表达LfcinBD,诱导表达5 d,每24 h取上清1 mL,进行抑菌试验.结果表明,抗菌肽牛乳铁多肽衍生肽基因已整合到酵母细胞基因组中并获得表达,经0.5%甲醇在30℃诱导48 h可产生较强抗菌活性的抗菌肽,而且对氨苄青霉素抗性的大肠杆菌亦有较强的抑菌作用.     

辣根过氧化物酶同工酶C基因在巴斯德毕赤酵母中的克隆与鉴定

目的：克隆辣根过氧化物酶同工酶C基因,为此基因的表达作准备。方法：用PCR方法从辣根的总DNA中扩增得到一种辣根过氧化物酶同工酶C基因HRPC2,通过PCR的方法去除内含子后连接到pMD18-T载体上,测序证明正确后,用限制性内切酶切下目的基因,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组质粒pC2EX9K。再将辣根过氧化物酶同工酶C基因在毕赤酵母中进行克隆、鉴定。结果：重组质粒pC2EX9K转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论：应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HRPC2。     

猪传染性胃肠炎病毒纤突糖蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的:利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)纤突糖蛋白S。方法:根据GenBank中猪TGEV纤突糖蛋白S全基因设计一对引物,并在5'引物和3'引物中引入EcoRⅠ、NotⅠ酶切位点,2.2kb的目的基因S经PCR扩增后克隆于pBS-T载体,再将S基因经双酶切从T载体切下并与穿梭质粒pPIC9k连接,SalⅠ线性化重组穿梭质粒pPIC9k-S,电转化于毕赤酵母GS115感受态细胞,G418筛选鉴定阳性重组子,经甲醇诱导,SDS-PAGE检测诱导后上清。结果:对pPIC9k-S重组酵母表达载体的测序证实已成功克隆了猪TGEVS基因;重组酵母菌诱导表达后,SDS-PAGE检测结果显示表达产物的相对分子质量约为82×103,且S蛋白以可溶性形式分泌表达于胞外。结论:利用巴斯德毕赤酵母真核表达系统成功表达了猪传染性胃肠炎病毒(河北分离株)纤突糖蛋白S。     

单纯疱疹病毒2型糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体的构建及序列分析

构建单纯疱疹病毒2型包膜糖蛋白D成熟肽基因毕赤酵母表达载体,并对序列进行分析,为进行高抗原性的真核表达重组gD蛋白奠定基础。采用PCR扩增HSV2-gD成熟肽基因,将该段基因克隆于pGEM-T克隆载体,转化鉴定后,与巴斯德毕赤酵母表达载体(pPIC9K)酶切连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选测序确定构建了pPIC9K?gD的真核表达载体,对克隆的序列进行分析,预测表达产物的理化特性及抗原性。结果显示,获得的重组的酵母表达载体pPIC9K-gD,测序结果证实为HSV2-gD成熟肽基因,序列分析其高度保守,预测蛋白分子量40.63kD,等电点pI为7.15,包含完整成熟肽分值达1.7的多个抗原决定簇。成功构建了HSV2-gD成熟肽基因的毕赤酵母表达载体。     

重叠延伸PCR法克隆人脂联素基因及其在毕赤酵母中表达

利用重叠延伸PCR法克隆出人脂联素基因, 连接至克隆载体pGEM-T中, 转化大肠杆菌DH5a, 通过测序对其进行序列分析后, 进一步构建毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN, 通过电击法转化毕赤酵母GS115, 转化的重组酵母菌用甲醇诱导外源基因表达。经PCR、Southern blotting鉴定, 获得了重组毕赤酵母菌株; 经甲醇诱导人脂联素基因表达, Western blotting杂交鉴定证明人脂联素基因已经在毕赤酵母中成功表达。结果表明重叠延伸PCR法准确方便克隆出人脂联素基因, 在30oC, 1%甲醇诱导48 h, 人脂联素基因在巴斯德毕赤酵母中的表达最佳。     

草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达

将草鱼生长激素基因（cGH）的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH的毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。     

HBcAg基因在甲醇型酵母中的表达、产物纯化及其性质的初步研究

为研究乙肝核心抗原蛋白(HBcAg)在甲醇型酵母(PichiaPastoris)中的表达和性质,用PCR方法将HBcAg基因(L)克隆到P.Pastoris胞内表达载体pPIC3k中,并利用电击和同源重组法,将重组质粒pPIC3kL转化感受态的甲醇型GS115酵母菌株。经过筛选得到阳性P.Pastoris重组子。重组菌株经甲醇诱导培养,表达产物的Western印迹结果表明,HBcAg蛋白能在甲醇型酵母(PichiaPastoris)中诱导表达,产物为一215kDa的蛋白。经蔗糖密度梯度超离心和CsCl密度梯度超离心纯化后,ELISA和密度测定结果表明重组HBcAg蛋白主要分布在密度为12576gml和13013gml的2个峰值处。电镜观察表明,该重组HBcAg蛋白能自主装配成大小不同的2种颗粒(即核心颗粒),大颗粒直径约34nm左右,小颗粒直径约30nm左右。同时,我们还观察到,该核心蛋白颗粒在体外可发生集聚现象。     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

目的通过构建毕赤酵母表达载体将香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中进行表达,同时对表达产物进行鉴定。方法从香菇菌C91-3菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3＇-Full RACE、5＇-Full RACE方法获得24414基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K中,构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414。用电转化的方法将此质粒转化到毕赤酵母GS115中并进行诱导表达,对表达产物用Westen-blot方法进行鉴定。结果通过菌落PCR和基因序列分析确定插入pPIC9K中的片段为24414基因片段,通过Westen-blot方法确定所表达蛋白为目的蛋白。结论重组质粒pPIC9K-24414成功构建,目的凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功表达,为进一步研究香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414的生物学功能奠定了基础。     

破伤风毒素保护性抗原在毕氏酵母中的分泌表达

采用PCR方法．从C.Tetani 64008菌株中扩增大小为1353bp的破伤风毒素与靶细胞起结合作用的重链C端基因(Tetc),直接连接pGEM-T栽体进行测序,并以pPIC9K为表达栽体构建重组表达质粒,经线形化的重组质粒电转化毕氏酵母细胞GS1l5和KM71．甲醇诱导获得了分泌表达,表达产物存在于培养上清中,占分泌蛋白的10％,通过免疫印迹可以检测到重组表达产物,活性测定表明,重组蛋白具特异结合活性,本研究通过实现破伤风毒素保护性抗原在酵母系统中的分泌表达、研究其影响因素,为其它细菌毒素蛋白高效可溶性表达,及进一步抗原片段介导保护性免疫研究及抗毒素制备奠定了基础。     

纤维连接蛋白C端肝素结合域多肽在毕赤酵母中的表达、纯化及鉴定

为在毕赤酵母中表达纤维连接蛋白C端肝素结合域(Fibronectin C-terminal heparin-binding domainFNCHBD)多肽并研究其功能,通过PCR技术扩增FNCHBD目的基因,将目的基因与T载体连接,经测序正确后,插入pAo815SM酵母表达载体增加基因拷贝数,然后酶切克隆入酵母表达载pPIC9K;将重组质粒Sal I酶切线性化后转化毕赤酵母菌株,筛选工程菌,经甲醇诱导表达,用SDS-PAGE检测发酵上清液,表明有重组蛋白FNCHBD多肽的高表达,表达产物通过离心、超滤、离子交换层析纯化,纯化产物通过SDS-PAGE、Western blotting印迹、质谱及肝素亲和层沉析对表达产物进行鉴定。结果表明利用酵母工程菌成功表达和纯化了FNCHBD多肽,多肽的分子量接近32 kDa,纯化产物的纯度可达95%以上,能被FN多克隆抗体特异识别且具有多肽肝素结合活性,为后续结构及功能的研究奠定基础。     

Cloning and expressing a recombinant human tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) in methylotrophic yeast Pichia pastoris and its characterizations

To obtain human tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2)cDNA and the secretory expression of TIMP-2 gene in Pichia pastoris,we designed and synthesized a 618 base pairs artificial gene coding for the TIMP-2 with a computer-aided design method using a standard chemical synthesis technique,which was composed of frequently used codons in the highly expressed Pichia pastoris genes.Then the synthetic gene encoding TIMP-2 was checked by means of dideoxynucleotide sequencing.The verified gene of TIMP-2 was cloned to the Escherichia coli-yeast shuttle vector of pPIC9 to construct a recombinant plasmid pPIC9-T2.The plasmid was transformed into GS115 cells of the methylotrophic yeast,Pichia pastoris by electroporation,and we got the expression cell through phenotype selection and induction with methanol.Separation,purification,and bioactivity analysis of the expressed products were performed.     

粗糙脉孢霉酸性蛋白酶基因的克隆与鉴定

以粗糙脉胞霉CICIM F00021染色体DNA为模板,通过PCR扩增得到粗糙脉胞霉酸性蛋白酶结构基因。对其序列进行了测定和分析,表明扩增得到的片段为酸性蛋白酶基因。将扩增出的酸性蛋白酶基因克隆入酵母表达载体中获得重组质粒pPIC9K-ap。将其转化入毕赤氏酵母获得重组菌NA3。重组酸性蛋白酶在pH4．0和45℃下表现出最高活性。     

人可溶性gp190在酵母Pichia pastoris中的表达

人可溶性gPl90(sgp190)是白血病抑制因子(LIF)的可溶性受体,可能在LIF行使众多生物学功能中扮演着重要的角色。为获得这一蛋白以研究它在人体内的生物学活性,在酵母Pichia pastoris中实现了重组sgp190分泌表达。利用基因重组技术,将编码人可溶性gP190(LlF受体α亚基gP190胞外区)cDNA克隆到毕赤酵母Pichia pastoris分泌表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-sgp190。原生质体法转染Pichia pastoris GS115菌株,经过G418筛选,得到了高效分泌表达sgp190蛋白的毕赤酵母菌株GS115／pPIC9K-sgp190,sgp190蛋白占摇瓶培养表达上清中总蛋白质的26％。经初步纯化,对表达产物的性质鉴定表明,其分子量约125kD,具有免疫活性。对sgp190体外活性分析表明它能够抑制LIF诱导滋养层细胞分泌hCG。     

Expression of functional soluble forms of human beta-1, 4-galactosyltransferase I, alpha-2,6-sialyltransferase, and alpha-1, 3-fucosyltransferase VI in the methylotrophic yeast Pichia pastoris

The cDNAs encoding soluble forms of human beta-1, 4-galactosyltransferase I (EC 2.4.1.22), alpha-2,6-sialyltransferase (EC 2.4.99.1), and alpha-1,3-fucosyltransferase VI (EC 2.4.1.65), respectively, have been expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. The vector pPIC9 was used, which contains the N-terminal signal sequence of Saccharomyces cerevisiae alpha-factor to allow entry into the secretory pathway. The recombinant enzymes had similar kinetic properties as their native counterparts. Their identity was confirmed by Western blotting. Recombinant enzymes may be used for in vitro synthesis of oligosaccharides.