一种基于过敏性反应机制的抗植物病毒侵染策略

基于植物的过敏性反应机制,构建了PVY Nib基因和来自于细菌Bacillus amy—loliquefaciens的一类Rnase基因Barnase基因的融合基因的植物表达载体。在此表达载体内两基因的拼接处,保留了原来PVY蛋白酶识别PVYNIb和CP蛋白剪切位点的七肽保守序列。通过农杆菌介导获得此融台基因的转基因烟草植株。病毒侵染试验表明,转基因植物在病毒侵染后,发病症状被改变。少部分转融合基因的植株对病毒侵染表现局部抗性。     

非寄主抗病基因Rxo1介导的水稻对Xanthomonas oryzae pv.oryzicola的抗病反应

通过表型鉴定、反转录PCR和实时定量PCR方法,利用转基因和非转基因水稻植株,研究由Rxol基因介导的,水稻对细菌性条斑病菌的抗性反应。结果观察到3个涉及过敏性反应的基因由Rxol基因诱导表达,并对其进行了分析。这3个基因参与编码病程相关蛋白,在转基因水稻植株中呈上调表达,表明水杨酸信号转导途径在抗性反应中发挥重要的作用。     

马铃薯块茎特异性启动子驱动的人白细胞介素-12的遗传转化研究

为获得高效表达人白细胞介素-12(h IL-12)蛋白的转基因马铃薯植株,利用根瘤农杆菌侵染法将前期构建的马铃薯块茎特异性启动子Ppatatin驱动的h IL-12植物表达载体导入马铃薯,通过共培养、筛选、分化等过程获得转基因植株,并结合PCR、RT-PCR、GUS染色及ELISA分析对转基因植株进行鉴定。结果显示,获得12个马铃薯转基因株系,PCR检测表明其中的10个株系目的基因已导入马铃薯基因组,转基因阳性率为83%;RT-PCR分析表明其中的7个株系外源基因在转录水平成功获得表达,ELISA分析表明其中的5个株系有明显的蛋白水平表达。对这7个株系后代的检测表明外源基因成功表达且具有良好的遗传稳定性。     

烟草NtWRKY40在植物应答病毒侵染过程中的作用

WRKY转录因子家族在植物的抗病、抗逆反应中具有重要功能。已有研究表明,烟草花叶病毒(TMV)的侵染显著地诱导烟草Nt WRKY的表达,有必要进一步探明该基因在植物应答病毒侵染过程中的作用。采用PCR的方法克隆获得Nt WRKY cDNA,生物信息学分析结果显示,该基因属于WRKYⅡa亚族成员,与绒毛状烟草NtoWRKY40高度同源,命名为NtWRKY40。以此建立了过表达该基因的转基因烟草,并以TMV为毒源进行了转基因烟草和野生烟草的侵染实验,以观察NtWRKY40在烟草应答病毒侵染过程中的作用。实验结果表明,野生烟草在TMV侵染后9 d,NtWRKY40的表达量显著升高,而NtWRKY40过表达转基因烟草在病毒侵染后,病毒相关基因的表达高于野生型对照,与染病程度成正相关,说明过表达NtWRKY40增加了植株对病毒的敏感性,该基因为负调控因子。此外,为探索应用人工miRNA的抗病毒技术,以烟草天然miR167前体为骨架、马铃薯Y病毒(PVY)外壳蛋白基因的一段反向互补序列为成熟序列,构建了amiR167-PVY植物表达载体并转化烟草,以抑制PVY。对amiRNA转基因植株进行抗病毒实验的结果显示,amiR167-PVY能够部分抑制病毒基因的表达,转基因植株具有一定的抗病毒能力。     

CMV抑制PVYN CP基因沉默及其介导的抗病性

以前曾报道用RNA介导的抗病毒策略,获得了高度抗病的表达马铃薯Y病毒坏死株系外壳蛋白基因(PVY^N CP)的转基因烟草,并对T1、T2代转基因植株进行了遗传和抗病性分析。此次以T,代转基因植株为试验材料,在筛选高度抗病植株并证明其抗病性是基于转基因沉默的基础上,采用Northern杂交的方法,证明CMV侵染抑制了转基因植株中PVY^N CP基因的沉默,而且CMV对PVY^N CP基因沉默的抑制部位是发生在接种后的新生叶上,接种叶及其下部叶片中PVY^N CP基因沉默则未受到影响。采用ELISA方法对CMV PVY^N复合接种的转基因植株进行PVY^N检测,结果表明,接种叶及下部叶没有检测到PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为抗病。而在CMV接种后植株新生叶中则检测出了高滴度的PVY^N,植株叶片对PVY^N表现为感病。该文报道了在表达PVY^N CP基因的RNA介导抗性转基因植株中,异源病毒侵染抑制了转基因的沉默,并导致转基因植株的抗病性丧失。     

马铃薯叶特异性启动子驱动的人白细胞介素-12的遗传转化

利用植物生物反应器表达具有应用价值的药用蛋白是近年来生物技术研究的热点之一。本研究利用前期构建的Prbcs驱动的h IL12植物表达载体,导入根瘤农杆菌后侵染马铃薯,通过筛选、分化等过程,获得转基因马铃薯植株。结果显示,获得13个独立的转h IL12基因阳性马铃薯株系,GUS染色分析表明外源基因成功获得表达,且具有良好的遗传稳定性。本研究获得的Prbcs驱动的h IL12转基因马铃薯植株,为下一步利用马铃薯高效表达生产h IL-12蛋白打下了基础。     

一种转录受病原物接种和机械创伤诱导的水稻WRKY基因的鉴定

WRKY基因编码一类植物特异性转录因子,该类基因目前在双子叶植物中得到了较好的研究.为了研究WRKY基因在单子叶植物中的生物学功能,从水稻(Oryza sativa L.)中分离了OsiWRKY基因的cDNA.该cDNA可编码一个含482个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质预测的一级结构中含有一个WRKY结构域,在该结构域中发现了一个典型的C2-H2锌指结构模块.OsiWRKY预测的一级结构中还可能含有一个细胞核定位因子;利用瞬时表达体系,发现OsiWRKY与GFP绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白的确定位在水稻细胞核中.在凝胶阻滞实验中,体外表达的OsiWRKY蛋白可特异地结合W-box顺式因子.在水稻白叶枯病原细菌接种实验中,OsiWRKy基因的转录本在抗病品种(IR-26)中的诱导增加强度明显高于感病品种(Jingang 30).在模拟接种的水稻中,OsiWRKy基因的转录本也表现诱导增加,但其诱导增加的起始时间和幅度要显著低于水稻白叶枯病原细菌接种的水稻植株.这些结果表明,OsiWRKY基因可能编码了一个含有WRKY结构域的转录因子,该转录因子可能参与了水稻对病原物接种和机械创伤的反应,但OsiWRKY蛋白调节两种反应的机制可能有所不同.     

马铃薯抗晚疫病转基因的研究进展

晚疫病是影响马铃薯最严重的一种真菌性病害,农业技术的综合应用、化学药剂的使用对晚疫病的防治存在种种弊端。因此,寻找新的抗病基因型,获得抗晚疫病的转基因新品种一直是马铃薯抗晚疫病的主要任务。本文简要介绍了马铃薯晚疫病的危害及防治,着重对从Osmotin蛋白诱导抗性、病原诱导葡萄糖氧化酶(GO)基因表达生成H2O2获得抗性、Harpin蛋白基因表达诱导抗性途径对马铃薯抗晚疫病转基因研究进展进行了综述,同时对转基因植物的生物安全性作了评价。     

致病疫霉效应蛋白Pi16275的功能研究

【目的】分析致病疫霉效应蛋白Pi16275的超量表达对病原菌致病性的影响,明确Pi16275的亚细胞定位,筛选Pi16275在植物中的互作靶标蛋白及靶标蛋白在抵御病原菌侵染过程中的作用,初步揭示Pi16275在病原菌侵染植物过程中的作用机制。【方法】利用农杆菌介导的烟草瞬时表达系统在烟草叶片表皮细胞中瞬时表达Pi16275并观察其亚细胞定位,同时在瞬时表达部位接种致病疫霉游动孢子并统计病斑面积;通过酵母核系统cDNA文库及酵母双杂交技术筛选、验证,确定Pi16275在马铃薯中的靶标蛋白;运用病毒介导的基因沉默技术在植物中沉默靶标蛋白基因,探究基因沉默是否影响植物对病原菌的抗性。【结果】在烟草叶片中瞬时表达Pi16275显著促进致病疫霉的侵染;Pi16275定位在植物细胞核、细胞质及细胞膜中;初步筛选到3个与Pi16275互作的马铃薯蛋白：40S核糖体亚基蛋白S5 (StRPS5)、粘蛋白2 (StMUC2)、V型ATP酶E亚基类似蛋白(StVAEL);沉默StRPS5的同源基因后显著降低了烟草对致病疫霉的抗性。【结论】Pi16275在致病疫霉侵染植物过程中发挥重要作用。     

Harpin的表达及其诱导抗烟草花叶病毒感染的活性

采用人工分段合成梨火疫病细菌(Erwinia amylovora)Harpin基因A、B、C、D片段,然后连接构建全长harpin基因,克隆到pET-23(+)表达载体中,在E.coli BL21中表达Harpin蛋白.通过His@Bind Resin Ni++ 层析柱纯化,获得Harpin蛋白.经SDS-PAGE和Western blot分析,该蛋白分子量为45 kDa.采用叶片穿刺法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发烟草叶片的过敏反应.采用叶脉注射法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发辣椒叶片的过敏反应.将烟草和辣椒用30μg/mL Harpin喷雾处理5d后,接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV),观察植株病症,并采用ELISA检测TMV含量.结果表明经Harpin处理的烟草和辣椒对TMV侵染有一定的抑制作用.     

一种转录受病原物接种和机械创伤诱导的水稻WRKY基因的鉴定

WRKY基因编码一类植物特异性转录因子,该类基因目前在双子叶植物中得到了较好的研究。为了研究WRKY基因在单子叶植物中的生物学功能,从水稻(Oryza sativa L.)中分离了OsiWRKY基因的cDNA。该cDNA可编码一个含482个氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质预测的一级结构中含有一个WRKY结构域,在该结构域中发现了一个典型的C2-H2锌指结构模块。OsiWRKY预测的一级结构中还可能含有一个细胞核定位因子;利用瞬时表达体系,发现OsiWRKY与GFP绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白的确定位在水稻细胞核中。在凝胶阻滞实验中,体外表达的OsiWRKY蛋白可特异地结合W-box顺式因子。在水稻白叶枯病原细菌接种实验中,OsiWRKY基因的转录本在抗病品种(IR-26)中的诱导增加强度明显高于感病品种(Jingang 30)。在模拟接种的水稻中,OsiWRKY基因的转录本也表现诱导增加,但其诱导增加的起始时间和幅度要显著低于水稻白叶枯病原细菌接种的水稻植株。这些结果表明,OsiWRKY基因可能编码了一个含有WRKY结构域的转录因子,该转录因子可能参与了水稻对病原物接种和机械创伤的反应,但OsiWRKY蛋白调节两种反应的机制可能有所不同。     

植物几丁质酶与病害防治研究进展

植物与病原物相互作用的关系问题,是植物病理学的中心内容之一,也是近年来进展最快的领域,其中有关植物病程相关蛋白(PR蛋白)的研究尤为引人注目。 为了对付病原物的入侵,植物通过进化形成了一整套复杂的、在不同水平上起作用的防卫系统。植物的一种重要的防卫系统是过敏性反应(HR反应);过敏性反应的结果形成植物的诱导抗性,包括局限于侵染点的局部诱导抗性和除侵染点外整株植物的系统性诱导抗性。诱导抗性在多种植物中已有报道,其生理生化基础正在逐步被阐明。     

马铃薯块茎形成相关基因STI-LIKE在拟南芥植株发育中的功能验证

马铃薯块茎的形成涉及一系列基因的表达和关闭。以马铃薯普通栽培品种"大西洋"为试验材料,采用RT-PCR扩增获得马铃薯STI-LIKE基因全长片段。RT-PCR定量分析表明,该基因在马铃薯营养器官中均有表达。生物信息学分析表明STI-LIKE蛋白具有3个TPR结构域,在高等植物中具有高同源性,是一个普遍存在的蛋白质。为验证STI-LIKE蛋白在拟南芥植株发育中功能,分别构建该基因强启动子表达载体(p BI121)和干扰载体(p HANNIBAL和p ART27),转化拟南芥获得了两种载体的拟南芥转基因植株,同时制备STI-LIKE蛋白抗体验证转基因植株蛋白表达。研究结果表明STI-LIKE基因可能参与拟南芥株型发育过程。     

马铃薯POTHR-1 cDNA的克隆及晚疫病菌和其他非生物因子诱导表达分析

利RACE和重叠延伸相结合的方法,从经晚疫病菌接种诱导的马铃薯水平抗性材料叶片中克隆了一个POTHE 1基因(potato Phytophthora infestans induced hypersensitive response related protein gene)的全长cDNA.序列分析表明,该基因编码225个氨基酸,与烟草harpin诱导蛋白基因hinl有很高的同源性(编码区核苷酸和氨基酸序列分别为83%和81%).Southern杂交结果显示在马铃薯基因组中有2～3个拷贝.对其诱导表达模式研究表明:晚疫病病原菌接种36 h后,该基因表达迅速增加;机械伤害及茉莉酸(JA)处理能够诱导表达;渗透胁迫(NaCl浸泡)能够诱导其微弱表达;但水杨酸(SA)不能诱导表达.该基因可能和病原与寄主互作时寄主产生过敏反应及细胞生理性死亡有关.     

Optimization of genetic transformation system of potato and introduction of maize starch branching enzyme gene SBEⅡb into potatoFAN

以马铃薯脱毒试管苗茎段为转化受体材料,建立并优化了农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系.通过农杆菌介导法将玉米淀粉分支酶基因(Starch branching enzyme b,SBEⅡb)的过表达载体转化马铃薯,接种762个茎段,共获得35株抗性植株.经PCR检测获得了4株转基因阳性植株;对转基因植株进一步进行GUS活性组织化学染色,发现转基因植株的茎段与试管薯均被染上蓝色,表明外源SBEⅡb基因已整合到马铃薯基因组,且正常表达.     

对增强辣椒疫霉菌抗性的研究

病原物诱导型启动子能精确控制抗病基因在侵染位点的表达,是抗病基因工程的有效工具。prp1-1是来自马铃薯谷胱甘肽巯基转移酶基因启动子的一个273bp的片段,能够快速准确地启动被侵染位点抗病基因的表达;Rs-AFP2是具有对致病性丝状真菌的广谱抗性。该研究构建prp1-1调控Rs-AFP2基因表达的载体,经农杆菌介导转化法导入辣椒。逆转录PCR检测发现,转基因辣椒只在受到疫霉菌孢子侵染时,才由prp1-1启动Rs-AFP2基因的转录。用疫霉菌孢子灌根接种转基因辣椒T1代植株,35株T1代辣椒中有29株表现出明显的疫霉菌抗性。另将23株T1代辣椒种于人工气候箱,发现其形态和发育特征与相同条件下的非转基因植株无明显区别。研究表明,prp1-1调控Rs-AFP2的诱导表达达到了增强辣椒疫霉菌抗性的目的,而且避免了负面效应的发生。     

枸杞Lb14-3-3c基因克隆及转化马铃薯的研究

在开花植物中,14-3-3蛋白对植物生长发育具有重要的调控作用。本试验利用逆转录PCR(RT-PCR)技术,从宁夏枸杞宁杞1号花药中克隆了一个14-3-3蛋白家族基因Lb14-3-3c。利用荧光定量PCR技术分析Lb14-3-3c基因在花药发育不同时期的表达特征,构建Lb14-3-3c基因的植物过表达载体pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3c(+)及植物抑制表达载体pCambia1305.1-35s-Lb14-3-3c(-),继而经农杆菌介导法将过表达载体转化马铃薯紫花白幼茎,获得了阳性转基因马铃薯植株。结果表明,Lb14-3-3c基因编码的蛋白与番茄处于进化树同一分枝上,亲缘关系最近。荧光定量PCR分析表明,该基因在枸杞各器官都有表达,在雄蕊中的表达量最高。在花药发育的各个时期均表达,且在小孢子母细胞时期表达量最高。成功将外源基因Lb14-3-3c载入含强启动子CaMV35s的植物表达载体中,并将该基因的植物过表达载体转化马铃薯,通过表型观察与PCR阳性鉴定得到5株转基因植株,发现转基因植株长势优于野生型植株,苗期野生型与转基因型淀粉含量相差不大,结薯期和成熟期转基因型马铃薯的叶片淀粉含量均高于野生型,且差异显著。本研究为进一步探讨Lb14-3-3c基因对枸杞花药发育过程中淀粉供能的调控提供了参考依据,并且为阐明Lb14-3-3c基因在植物发育过程中的功能及枸杞的分子遗传改良提供了研究基础。     

表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染

通过土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)的cDNA成功地引入番茄(Lycopersicon esculentum)植株中,并得到转基因植株。用强致病力CMV株系接种后,表达CMV外壳蛋白的转基因植株表现出对CMV侵染的抗性。转基因植株RI代的抗性基因以接近3:1比例分离。对R_1代接种CMV后,表达CMV CP的植株病症减轻,发病率、病情指数及病毒积累量明显低于对照。病症出现推迟1个多月。     

Harpin的表达及其诱导抗烟草花叶病毒感染的活性

采用人工分段合成梨火疫病细菌(Erwinia amylovora)Harpin基因A、B、C、D片段,然后连接构建全长harpin基因,克隆到pET-23( )表达载体中,在E．coli BL21中表达Harpin蛋白。通过His Bind Resin Ni^ 层析柱纯化,获得Harpin蛋白。经SDS-PAGE和Western blot分析,该蛋白分子量为45kDa。采用叶片穿刺法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发烟草叶片的过敏反应。采用叶脉注射法,5μL 30μg/mL Harpin能诱发辣椒叶片的过敏反应。将烟草和辣椒用3μg／mL Harpin喷雾处理5d后,接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),观察植株病症,并采用ELISA检测TMV含量。结果表明经Harpin处理的烟草和辣椒对TMV侵染有一定的抑制作用。     

dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）及PRSV寄主植物番木瓜（CaricapapayaL.）作为试验材料,开展了番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因dsRNA介导的PRSV病原抗性的研究。利用农杆菌介导法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR（简称PHG12-CPIR）分别转化到烟草和拟南芥中,获得阳性植株,并利用渗透法和农杆菌介导的瞬时表达体系将pHG12-CPIR载体导入到番木瓜中。对转基因植株进行攻毒试验并分析了其抗病性。在接种3~7d内,在拟南芥和番木瓜上转基因植株的发病情况较轻,而野生型植株叶片与转基因植株相比,均表现出不同程度的黄化、皱缩和枯斑等症状。在接种PRSV后,番木瓜和拟南芥转化植株表现症状的叶片的比例与对照相比,结果显著低于对照,而在烟草植株上症状表现的差异不明显。在3种植物上RT-PCR检测结果显示,在接种番木瓜环斑病毒PRSV后,野生型植株中有高浓度的病毒积累,而转pHG12-CPIR基因植株中几乎没有病毒积累,推测转pHG12-CPIR基因植株中瞬时表达系统已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。