微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用的鉴定

为鉴定微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1在肝脏组织的功能,采用GST pull-down结合质 谱技术,检测该蛋白在肝脏中的结合蛋白,结果提示,肌球蛋白Ⅵ与HSPC300/hHBRK1共沉降,Western 印迹杂交证实了质谱的结果．构建HSPC300/hHBRK1原核表达载体,诱导并获得了His-hHBRK1融合蛋白．利用免疫共沉淀证实hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ存在相互作用,激光共聚焦检测显示hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ在肺癌95D细胞的胞浆共定位,提示其相互作用可能是直接结合．肌球蛋白Ⅵ参与细胞迁移、高尔基分泌泡的运输和维持高尔基体稳定性等作用．hHBRK1与肌球蛋白Ⅵ相互作用,为微丝相关蛋白HSPC300/hHBRK1参与细胞迁移和胞内物质运输提供了进一步佐证．     

微丝相关新基因hHBrk1的克隆及功能鉴定

微丝相关新基因hHBrk1被克隆 .hHBrk1基因位于 3p2 5 3 2 4 1区 ,由 3个外显子和 2个内含子组成 .Northern印迹杂交结果表明hHBrk1基因有 2个转录本 ,在人体 12种组织中均有表达 ,尤以心肌和骨骼肌为著 .hHBRK1蛋白含 75个氨基酸 ,分子量约 9kD ,与动植物界相关蛋白的同源性达 98%～ 35 % .hHBRK1蛋白定位于细胞浆 ,在细胞运动的最前沿富集 ;在有丝分裂期 ,hHBRK1蛋白定位于细胞膜皮质区和缢缩环 .实验结果提示 ,hHBRK1蛋白可能通过调控F 肌动蛋白的聚合而参与调控细胞运动、分化等基础生命活动 .     

人微丝相关蛋白hHBRK1突变体的亚细胞定位

 hHBrk1是本研究室利用抑制性消减杂交手段,从人支气管上皮细胞恶性转化株BERP3 5中克隆到的差异高表达基因.hHBRK1蛋白家族序列在动、植物界高度保守,含有一个7重复 (heptad repeat, HR) 结构域.利用绿色荧光蛋白(GFP)报告系统,发现野生型hHBRK1蛋白在胞浆中弥散分布,在细胞运动前沿富集,与细胞片状伪足的微丝共定位.hHBRK1- R54和hHBRK1-S56 G57蛋白在胞浆弥散分布,但失去了在细胞运动前沿富集的特征.hHBRK1ΔN(1-45)在细胞内弥散分布,而hHBRK1ΔC(46-75)选择性地在高尔基体富集.研究提示,hHBRK1蛋白为微丝相关蛋白,结构的完整性是其发挥功能的前提.hHBRK1蛋白可能通过HR结构域调控微丝聚合,从而参与微丝依赖性的细胞运动或物质运输.     

ISL1与PHF8相互作用促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞的分化

近年的研究发现,在心肌细胞分化过程中,转录因子可以与表观修饰蛋白质结合进行更为精细的转录调控.作为转录因子的胰岛素基因增强子结合蛋白1（islet1, ISL1）,在心血管发育过程中发挥至关重要的作用.然而, ISL1是否能够与表观修饰蛋白质相互作用,从而发挥更为精细的调控作用,目前尚未明确.本室研究发现,ISL1在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,能够与组蛋白去甲基化酶PHD指蛋白8(PHF8)相互作用从而促进分化. 实时RT-PCR和Western 印迹的方法检测显示,ES细胞向心肌细胞分化过程中ISL1和PHF8具有相似的表达谱.通过免疫共沉淀的方法检测分化过程中ISL1与PHF8的结合,通过染色质免疫沉淀的方法对二者在ISL1下游靶基因增强子区的结合水平进行检测,利用实时RT-PCR检测二者的相互结合对心肌细胞分化的影响.结果显示,ISL1能够与PHF8相互作用,共同结合在ISL1下游靶基因Mef2c和Myocd的增强子区,协同促进ES细胞向心肌细胞的分化.本研究证实,在心肌细胞分化过程中,ISL1存在与表观修饰蛋白质PHF8的相互作用,从而进一步促进心肌细胞的分化.     

核蛋白MARVELD1与核质转运受体蛋白Importin β1相互作用的鉴定

核蛋白MARVELD1（MARVEL domain containing 1）是一个在多种肿瘤中表达下调的肿瘤相关基因. 为寻找其相互作用分子,构建pGEX-4T-2/MARVELD1重组体并在大肠杆菌中成功表达GST-MARVELD1融合蛋白. 采用GST pull-down 结合LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）的方法对MARVELD1蛋白的相互作用分子进行筛选,发现了16个与MARVELD1相互结合的蛋白. 进一步的免疫共沉淀实验证实, MARVELD1与核质转运受体蛋白importin β1能够相互作用,说明MARVELD1可能参与了importin β1的部分生物学作用, 或是它通过与importin β1结合而进入细胞核. 研究结果为进一步分析MARVELD1和importin β1的生物学功能奠定了基础.     

ISL1与PHF8相互作用促进小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化

近年的研究发现,在心肌细胞分化过程中,转录因子可以与表观修饰蛋白质结合进行更为精细的转录调控.作为转录因子的胰岛素基因增强子结合蛋白1(islet1,ISL1),在心血管发育过程中发挥至关重要的作用.然而,ISL1是否能够与表观修饰蛋白质相互作用,从而发挥更为精细的调控作用,目前尚未明确.本室研究发现,ISL1在小鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中,能够与组蛋白去甲基化酶PHD指蛋白8(PHF8)相互作用从而促进分化.实时RT-PCR和Western印迹的方法检测显示,ES细胞向心肌细胞分化过程中ISL1和PHF8具有相似的表达谱.通过免疫共沉淀的方法检测分化过程中ISL1与PHF8的结合,通过染色质免疫沉淀的方法对二者在ISL1下游靶基因增强子区的结合水平进行检测,利用实时RT-PCR检测二者的相互结合对心肌细胞分化的影响.结果显示,ISL1能够与PHF8相互作用,共同结合在ISL1下游靶基因Mef2c和Myocd的增强子区,协同促进ES细胞向心肌细胞的分化.本研究证实,在心肌细胞分化过程中,ISL1存在与表观修饰蛋白质PHF8的相互作用,从而进一步促进心肌细胞的分化.     

F1-V重组亚单位疫苗对鼠疫耶尔森氏菌141强毒株皮下攻毒保护性的研究

在此实验中, 设计了一种包含2种成分的重组融合蛋白作为疫苗成分来防护鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia)可能产生的生物威胁. 重组F1-V蛋白与铝佐剂结合, 分别以10, 20, 50 mg剂量免疫BALB/C小鼠, 周期为2个月. 检测小鼠血清抗体水平和T辅助细胞的亚型. 免疫后小鼠以25~600 LD₅₀剂量的鼠疫耶尔森氏菌141强毒株进行皮下攻毒实验. 结果证明, F1-V重组蛋白在 小鼠体内诱导产生足够保护的免疫应答. 血清IgG水平是产生最终保护力的一个重要因素. 20 μg的免疫剂量可以诱导血清抗体效价高达51200, 使小鼠对400 LD50的鼠疫耶尔森氏菌产生100%的保护. F1-V重组蛋白引发的抗体亚型主要为IgG1类, 说明抗体反应趋向Th2型反应. 流式细胞分析表明, 铝佐剂主要帮助F1-V重组融合蛋白诱导强烈的体液免疫而不是CTL细胞免疫应答.表明F1-V重组亚单位疫苗株有希望成为一种新型的鼠疫疫苗候选株.     

小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。     

小鼠基质重塑相关7（MXRA7）基因产物在肝脏内互作蛋白质的鉴定

基质重塑相关7（matrix remodeling associated 7,MXRA7）基因于2002年被命名,但无论在人类或其他动物体系,该基因或其蛋白质产物的功能均未知。直至我们最近的研究表明,该基因可能参与眼睛发育或肝损伤及修复。在本研究中,应用酵母双杂交策略,用小鼠MXRA7诱饵载体对小鼠肝cDNA文库进行筛选,发现23种蛋白质（MUP1, Cpt1a, Mat1a, aldh1l1, Cytb, H2-K1, Psmb1, marc2, Atp5j2, Sec24D, Trf, Rdh7, Apoe, Glud1, Gmfb, Alb, Hdlbp, Pzp, Etnk2, Nrn1, Serpina1a, Apoa2, GNMT）可能直接或间接地与MXRA7蛋白发生相互作用。其中,主要尿蛋白1（major urinary protein,MUP1）或其同家族蛋白质占所有候选克隆的1/6,提示其很可能是小鼠肝内与MXRA7蛋白有较强相互作用的蛋白质。通过基因重组在Hepa 1-6肝癌细胞系中同时过表达MXRA7和MUP1蛋白,荧光染色证明这两种蛋白质在细胞内共定位,应用抗MXRA7或MUP1的抗体进行Pull-down检测,则证明二者共同存在于细胞裂解液中。另外,重组MXRA7蛋白和MUP1蛋白在无任何其他蛋白质的缓冲液体系中直接形成复合体。因此,至少在小鼠肝组织体系中,MXRA7蛋白可能通过与MUP1等蛋白质的相互作用而发挥作用。     

小鼠基质重塑相关7(MXRA7)基因产物在肝内互作蛋白质的鉴定（英文）

基质重塑相关7(matrix remodeling associated 7,MXRA7)基因于2002年被命名,但无论在人类或其他动物体系,该基因或其蛋白质产物的功能均未知。直至我们最近的研究表明,该基因可能参与眼睛发育或肝损伤及修复。在本研究中,应用酵母双杂交策略,用小鼠MXRA7诱饵载体对小鼠肝cDNA文库进行筛选,发现23种蛋白质(MUP1, Cpt1a, Mat1a, aldh1l1, Cytb, H2-K1, Psmb1, marc2, Atp5j2, Sec24D, Trf, Rdh7, Apoe, Glud1, Gmfb, Alb, Hdlbp, Pzp, Etnk2, Nrn1, Serpina1a, Apoa2, GNMT)可能直接或间接地与MXRA7蛋白发生相互作用。其中,主要尿蛋白1(major urinary protein,MUP1)或其同家族蛋白质占所有候选克隆的1/6,提示其很可能是小鼠肝内与MXRA7蛋白有较强相互作用的蛋白质。通过基因重组在Hepa 1-6肝癌细胞系中同时过表达MXRA7和MUP1蛋白,荧光染色证明这两种蛋白质在细胞内共定位,应用抗MXRA7或MUP1的抗体进行Pull-down检测,则证明二者共同存在于细胞裂解液中。另外,重组MXRA7蛋白和MUP1蛋白在无任何其他蛋白质的缓冲液体系中直接形成复合体。因此,至少在小鼠肝组织体系中,MXRA7蛋白可能通过与MUP1等蛋白质的相互作用而发挥作用。     

SOX4能与p53蛋白发生相互作用

目的：研究SOX4和p53蛋白之间的相互作用。方法：应用GSTpull-down、免疫共沉淀实验验证相互作用。结果：GSTpulldown实验证实SOX4能结合GST-p53融合蛋白,但不能结合GST蛋白;免疫共沉淀实验也证明,SOX4与p53能在细胞内发生相互作用。结论：SOX4能与p53发生相互作用,为p53信号通路的研究提供了新的线索。     

人巨细胞病毒UL55编码蛋白结合蛋白的筛选与鉴定

从人胎脑c DNA文库中筛选和鉴定出与人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)UL55编码蛋白结合的蛋白。将UL55基因编码区克隆到诱饵载体p GBKT7中,在证实UL55蛋白不具有自激活作用的前提下,采用Match-maker GAL酵母双杂交系统筛选人胎脑c DNA文库中与UL55蛋白结合的宿主蛋白,用酵母双杂交回转实验验证UL55蛋白与获得的蛋白结合的可靠性。将酵母双杂交筛选出的文库蛋白烯醇化酶1(enolase1,ENO 1)构建到p GEX-4T-2载体上,利用GST pull-down技术体外验证ENO 1与HCMV UL55蛋白的结合。并依据所筛选出蛋白的生物学功能分析UL55蛋白可能的生物学功能。结果显示有10种蛋白与HCMV UL55编码蛋白结合。应用GST pull-down技术检测到ENO 1与HCMV UL55相互结合的蛋白条带。成功地筛选出10种与UL55蛋白相互结合的宿主蛋白,GST pull-down实验进一步表明ENO 1可以与HCMV UL55蛋白直接结合,为进一步研究UL55蛋白的功能提供了新的线索。     

GST pull-down验证流感病毒PB1-F2蛋白与热休克蛋白40的相互作用

为体外验证流感病毒PB1-F2与热休克蛋白Hsp40相互作用,通过两个方向的GST pull-down试验验证PB1-F2与Hsp40的相互作用。构建GST-多肽融合蛋白原核表达载体pGEX-6P-1-PB1-F2和pGEX-6P-1-Hsp40,并在大肠杆菌(E.co-li)BL21中诱导表达;构建真核表达载体pLEGFP-Hsp40及pCAGGS-PB1-F2,并分别转染293T细胞使其表达Hsp40及PB1-F2融合蛋白,然后进行GST pull-down试验验证二者的相互作用。成功地构建了两种蛋白的各种表达载体,经表达、纯化获得了可溶性的GST-多肽融合蛋白,GST pull-down试验正反两方向都证实了PB1-F2与Hsp40的相互作用,初步证实了流感病毒PB1-F2在体外能与Hsp40发生相互作用。     

Identification of a surface on the beta-propeller protein RACK1 that interacts with the cAMP-specific phosphodiesterase PDE4D5

A strategy of mutagenesis followed by yeast two-hybrid assay was used to determine the sites on the WD-repeat protein Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) necessary for it to interact with the cAMP-specific phosphodiesterase isoform PDE4D5. Analysis of deletion mutations demonstrated that WD-repeats 5-7, inclusively, of RACK1 contained the major site for interaction with PDE4D5. A reverse two-hybrid screen focusing on WD-repeats 5-7 of RACK1 isolated 11 single amino acid mutations from within this region that blocked the interaction. The ability of these mutations to block the interaction was confirmed by "pull-down" assays using bacterially expressed glutathione-S-transferase (GST)-RACK1 and mammalian cell-expressed PDE4D5. A model of RACK1 structure, based on the structural similarity of RACK1 to other beta-propeller WD-repeat proteins, indicated that the majority of the amino acids identified by mutagenesis are clustered in a discrete surface of RACK1. We propose that this surface of RACK1 is the major site for its interaction with the unique amino-terminal region of PDE4D5.     

Participation of the extracellular domain in (pro)renin receptor dimerization

The (pro)renin receptor [(P)RR] induces the catalytic activation of prorenin, as well as the activation of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathway; as such, it plays an important regulatory role in the renin–angiotensin system. (P)RR is known to form a homodimer, but the region participating in its dimerization is unknown. Using glutathione S-transferase (GST) as a carrier protein and a GST pull-down assay, we investigated the interaction of several (P)RR constructs with full-length (FL) (P)RR in mammalian cells. GST fusion proteins with FL (P)RR (GST-FL), the C-terminal M8-9 fragment (GST-M8-9), the extracellular domain (ECD) of (P)RR (GST-ECD), and the (P)RR ECD with a deletion of 32 amino acids encoded by exon 4 (GST-ECDd4) were retained intracellularly, whereas GST alone was efficiently secreted into the culture medium when transiently expressed in COS-7 cells. Immunofluorescence microscopy showed prominent localization of GST-ECD to the endoplasmic reticulum. The GST pull-down analysis revealed that GST-FL, GST-ECD, and GST-ECDd4 bound FLAG-tagged FL (P)RR, whereas GST-M8-9 showed little or no binding when transiently co-expressed in HEK293T cells. Furthermore, pull-down analysis using His-tag affinity resin showed co-precipitation of soluble (P)RR with FL (P)RR from a stable CHO cell line expressing FL h(P)RR with a C-terminal decahistidine tag. These results indicate that the (P)RR ECD participates in dimerization.     

端粒蛋白TRF1与肌动蛋白结合蛋白PFN2相互作用的鉴定

目的:鉴定端粒蛋白TRF1和肌动蛋白结合蛋白PFN2是否存在相互作用,并且两者的相互作用是否与端粒在细胞核周的锚定有关。方法:将TRF1构建到myc标签载体,PFN2构建到GST标签载体,采用GST-pull down技术,验证两者是否存在相互作用;同时将TRF1构建到EGFP标签的绿色荧光载体,PFN2构建到RED标签的红色荧光载体,两者共转入细胞,利用荧光显微镜观察两者在细胞中的共定位情况。结果:GST-pull down证明TRF1与PFN2存在直接相互作用,两者在细胞中可以共定位。结论:TRF1与PFN2存在相互作用,且这种相互作用发生在细胞核周。     

Tau融合蛋白及其缺失突变体与朊蛋白的体外作用分析

在部分朊病毒病（prion diseases）中,高度磷酸化的微管相关蛋白tau与朊蛋白(prion protein,PrP)发生共定位,tau蛋白可能在朊病毒病的病理机制中有重要作用. 本室已经证明二者可以发生分子间相互作用,本文进一步分析了tau蛋白与prion的体外相互作用及作用位点. 利用RT-PCR方法从人源细胞系SHSY5Y cDNA中扩增出微管相关蛋白tau全长cDNA序列,克隆至质粒pGEX-2T载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白GST-tau. 利用GST pull-down及免疫共沉淀方法检测全长tau蛋白与PrP23-231的分子间相互作用. 进一步表达tau 蛋白的各种缺失突变体,确定tau蛋白与PrP蛋白的相互作用位点. 结果表明,所表达的全长tau蛋白及各种缺失突变体均为可溶性蛋白,Western印迹结果显示,各种蛋白均能很好的被tau蛋白单抗识别. GST pull-down和免疫共沉淀实验均显示,原核表达的全长tau蛋白可与全长的PrP蛋白在体外发生相互作用,并确定相互作用位点位于tau蛋白的N端序列及中段的重复区. 上述结果为研究tau蛋白与PrP的相互作用在朊病毒病的发病机制中的意义提供了一定的理论基础.     

Human Dectin-1 isoform E is a cytoplasmic protein and interacts with RanBPM

Human Dectin-1, a type II transmembrane receptor, is alternatively spliced, generating eight isoforms. Of these isoforms, the isoform E (hDectin-1E) is structurally unique, containing a complete C-type lectin-like domain as well as an ITAM-like sequence. So far, little is known about its function. In the present study, we demonstrated that hDectin-1E was not secreted and it mainly resided in the cytoplasm. Using yeast two-hybrid screening, we identified a Ran-binding protein, RanBPM, as an interacting partner of hDectin-1E. GST pull-down assays showed that RanBPM interacted directly with hDectin-1E and the region containing SPRY domain was sufficient for the interaction. The binding of hDectin-1E and RanBPM was further confirmed in vivo by co-immunoprecipitation assay and confocal microscopic analysis. Taken together, our data provide a clue to the understanding of the function about hDectin-1E.