小黑杨PsnAP1-1及PsnAP1-2基因的克隆及原核表达分析

植物由营养生长向生殖生长的过程中,APETALA1(AP1)基因在其中起重要作用。我们采用RT-PCR方法克隆了2个杨树AP1同源基因全长cDNA,暂时命名为PsnAP1-1(GenBank No.KC866354)和PsnAP1-2(GenBank No.KC866355)。PsnAP1-1编码241个氨基酸,开放阅读框长度为726 bp,蛋白质分子量为28.1 kD,等电点为8.19;PsnAP1-2编码249个氨基酸,开放阅读框长度为750 bp,蛋白质分子量为28.7 kD,等电点为9.07。同源性分析表明,PsnAP1-1的核苷酸序列与拟南芥AP1同源基因的一致性为71%,而PsnAP1-2的同源性为67%。半定量RT-PCR分析表明,杨树PsnAP1-1和PsnAP1-2基因在根、茎、叶中均不表达,仅仅在花芽组织中表达。分别构建了原核表达质粒pET-PsnAP1-1和pET-PsnAP1-2,并转化大肠杆菌BL21,以IPTG诱导该融合蛋白体外表达,结合SDS-PAGE分析,证实这2个基因均表达了约35 kD的蛋白,该结果为深入研究AP1与其他MADS-box蛋白的互作机制及花分生组织的分子调控奠定了基础。     

麻竹miR172a靶基因DlAP2的克隆及其表达

为了解开花麻竹(Dendrocalamus latiflorus)的Dl AP2基因功能,采用RT-PCR和RACE技术克隆了mi R172a靶基因AP2同源序列c DNA全长,命名为Dl AP2。结果表明,Dl AP2基因c DNA全长为1729 bp,包含5′端非编码区81 bp、开放阅读框1464 bp、3′端非编码区160 bp和24个碱基的Poly A尾巴,在编码框靠近3′端130 bp处有1个高度匹配mi R172a的结合位点(CTGCAGCATCATCAGGATTCT)。Dl AP2编码487个氨基酸的蛋白,具有两个AP2结构域,属于AP2/ERF家族AP2亚家族的AP2组,与来自其它单子叶植物的AP2蛋白均有较高同源性。RLM-5′RACE分析表明,mi R172a主要在靶序列的第11~12个碱基之间剪切靶基因Dl AP2的mi RNA。q RT-PCR结果表明,麻竹花芽中Dl AP2基因的表达规律与mi R172a表达变化正好相反,证明mi R172a对Dl AP2基因的表达具有调控作用。     

利用阵列分析水稻AP2/EREBP 家族基因的表达特性

AP2/EREBP蛋白是广泛存在于高等植物中的且包含AP2/EREBP功能域的重要转录因子家族, 通常可分为包含单功能域的EREBP类蛋白和包含两个功能域的AP2类蛋白, 它们的功能涉及植物生长发育调控和对逆境应答等许多方面。据预测,水稻基因组编码150个左右的AP2/EREBP 家族成员, 但目前绝大多数蛋白的功能仍不清楚。为了解这些基因在水稻不同器官中的表达特性, 我们以AP2/EREBP功能域的氨基酸序列为基础, 从水稻基因组数据库中搜索到12个AP2类以及20个EREBP类预测基因, 利用PCR扩增的编码区序列制备了这些预测基因的macro-array。 以幼芽、幼根、幼叶、颖花和灌浆期成熟叶的 cDNA为探针, 杂交分析结果显示: 不同AP2类预测基因之间的表达量差别较大, 但同一个基因在不同器官中表达量基本一致; 与此不同的是, 大部分EREBP类预测基因在幼根和成熟叶片中表达量较高, 而在幼芽和幼叶中表达量较低。这些预测基因的表达模式可能与它们的功能密切相关。     

簸箕柳AP3同源基因SsMADS的克隆与特性分析

用cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)方法从簸箕柳雄花序中克隆了一个AP3同源基因的cDNA,长826 bp,包括完整的编码区、5′-UTR和3′-UTR,并将其相应的基因命名为SsMADS。该基因由7个外显子和6个内含子组成,编码区长723 bp,编码241个氨基酸,其N-端具有典型的MADS保守结构域。序列分析表明,SsMADS编码的氨基酸序列与毛果杨(Populus trichocarp)AP3同源蛋白有95.7%相似性,与其他几种柳属植物的AP3同源蛋白相似性达96.1%～99.6%。实时定量RT-PCR表明,SsMADS在叶、茎和根中表达量极低,在花序中表达量较高,并且其表达量在花器官的早中期发育阶段逐步提高,说明该基因在簸箕柳花器官的发育中起作用。     

利用阵列分析水稻AP2/EREBP家族基因的表达特性

AP2／EREBP蛋白是广泛存在于高等植物中的且包含AP2／EREBP功能域的重要转录因子家族，通常可分为包含单功能域的EREBP类蛋白和包含两个功能域的AP2类蛋白，它们的功能涉及植物生长发育调控和对逆境应答等许多方面。据预测．水稻基因组编码150个左右的AP2／EREBP家族成员，但目前绝大多数蛋白的功能仍不清楚。为了解这些基因在水稻不同器官中的表达特性，我们以AP2／EREBP功能域的氨基酸序列为基础，从水稻基因组数据库中搜索到12个AP2类以及20个EREBP类预测基因，利用PCR扩增的编码区序列制备了这些预测基因的macro—array。以幼芽、幼根、幼叶、颖花和灌浆期成熟叶的cDNA为探针，杂交分析结果显示：不同AP2类预测基因之间的表达量差别较大，但同一个基因在不同器官中表达量基本一致：与此不同的是，大部分EREBP类预测基因在幼根和成熟叶片中表达量较高，而在幼芽和幼叶中表达量较低。这些预测基因的表达模式可能与它们的功能密切相关。     

兜兰DEFICIENS(DEF)-和GLOBOSA(GLO)-like基因的克隆及表达分析

以‘同色兜兰’品种为材料,采用RT-PCR和RACE技术获得了DEFICIENS(DEF)-和GLOBOSA(GLO)-like基因的cDNA全长,命名为PcDEF和PcGLO,并用半定量RT-PCR和实时PCR研究了PcDEF和PcGLO在花芽发育过程和不同组织部位的表达特性。结果表明,PcDEF和PcGLO的全长cDNA分别为1 039bp和934bp,分别编码224和210个氨基酸;蛋白比对表明,PcDEF和PcGLO蛋白都具有典型MADS-box蛋白的MADS和K结构域;蛋白同源性分析显示,PcDEF和PcGLO与已登录的其它兰科植物的DEF/AP3和GLO/PI蛋白的相似性分别在75%～96%和87%～98%;系统进化树分析表明,PcDEF和PcGLO分别属于B类MADS-box蛋白家族的AP3和PI亚家族。表达分析显示,PcDEF和PcGLO在花芽发育中均有表达,PcDEF在成熟花、唇瓣和花瓣中的表达量高,在蕊柱、萼片、苞叶和根中次之,在花茎和叶中较低,在子房中几乎不表达;PcGLO在各组织中均有不同丰度的表达。     

大豆GmAP1基因的功能初探

以大豆天隆1号为材料,根据Glycine max Wm82.a2.v1中大豆基因组的预测序列,克隆出一个AP1同源基因,命名为GmAP1。该基因编码区CDS长度为711 bp,编码一个含236个氨基酸的蛋白质。对蛋白质序列的结构分析结果显示GmAP1蛋白符合MADS-box基因家族特征。为了初步分析GmAP1的功能,利用实时定量RT-PCR分析GmAP1在不同花器官中表达,并且在拟南芥中过表达该基因。在不同花器官中,GmAP1表达量不同,在花萼中表达量较高;花瓣次之。GmAP1过表达植株表现出早花、植株矮小以及花器官(花瓣、雄蕊和雌蕊)数量增多等表型。结果表明,大豆的GmAP1是一个功能保守的AP1基因,在花的发生和花器官发育中起着重要作用。     

FaSPS1基因对草莓果实成熟调控的分子机理

该研究以草莓品种‘红颜’(Fragaria×ananassa‘Benihoppe’)为试材,分析了草莓果实发育不同阶段蔗糖磷酸合成酶基因(FaSPS1)的表达量变化,采用PCR方法克隆FaSPS1基因,构建带有报告基因的e-GFP植物表达载体,通过瞬时转基因方法转化草莓果实,采用观察绿色荧光和检测目的基因表达量的方法鉴定转基因植物,并分析FaSPS1基因超表达和反义表达后草莓果实的成熟发育以及与成熟相关的基因表达量变化,探究FaSPS1基因在果实成熟发育中的特殊作用,为深入了解草莓果实发育和成熟调控的分子机理提供思路。结果显示:(1)成功克隆得到FaSPS1基因(GenBank登录号AB267868.1);成功构建带有报告基因e-GFP的FaSPS1基因超表达载体和反义基因表达载体,通过瞬时转基因方法转化并经荧光和目的基因表达量检测的方法鉴定获得转FaSPS1基因草莓植株。(2)与空载对照和非转基因果实相比,FaSPS1基因过表达可促进草莓果实成熟,能够使草莓果实成熟期提前,且果实中蔗糖果糖含量升高;但反义表达后会抑制草莓果实成熟,果实中苹果酸含量升高。(3)基因超表达或者反义表达后,草莓果实成熟相关基因的表达量受到不同程度调控,其中糖代谢基因FaSPS2/3、FaSUT1,果实成软化基因FaEXP1、FaEXP3、FaXYL1以及激素代谢基因FaJAZ1、FaJAZ2、FaJAZ8、FaOPR3、FaPYL1、FaPYL8、FaPYL9、FaNCED1表达量变化最明显。研究推测,FaSPS1基因可能通过影响草莓果实中和成熟相关的糖代谢基因、果实软化基因以及激素代谢基因来调控草莓果实成熟。     

森林草莓SUN基因家族的鉴定及其对逆境的响应

SUN基因是调控植物生长发育的关键基因。本研究鉴定了二倍体森林草莓(Fragaria vesca)的SUN基因家族,并对各成员的理化性质、基因结构、系统进化以及基因表达进行了分析。结果表明,森林草莓有31个FvSUN基因,其编码蛋白可聚类为7个组,同一组内成员具有高度相似的基因结构与编码蛋白保守域;FvSUNs蛋白的亚细胞定位主要在细胞核中。共线性分析表明森林草莓FvSUNs基因家族主要通过染色体片段复制产生,拟南芥与森林草莓存在23对直系同源基因。利用森林草莓的转录组数据,对FvSUNs基因的组织表达特征进行分析,发现主要可归为3类：各组织均表达、组织中几乎不表达、组织特异性表达,并通过实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)进一步验证结果。此外,还对森林草莓进行不同的逆境胁迫处理,qRT-PCR分析了31个FvSUNs基因的表达情况,发现大部分基因均在不同程度上受低温、高盐或干旱胁迫的诱导表达。这些研究结果为深入揭示草莓SUN基因的生物学功能及其分子机制奠定了基础。     

草莓钙依赖蛋白激酶基因的克隆与表达分析

以EST测序结合RACE技术,从久香草莓的茎尖中分离得到一个新基因,BLASTX分析显示这是一个钙依赖蛋白激酶编码基因,与GenBank中的FaCDPK1同源,命名为FaCDPK2,GenBank登录号为HQ829293.采用半定量RT-PCR对FaCDPK2基因在不同组织中的表达分析表明,FaCDPK2全长3 775 bp,读码框1 659bp,由12个外显子组成,编码552个氨基酸残基,在第89~349位是保守的蛋白激酶结构域,C端含4个EFhand钙结合域.该基因编码蛋白与拟南芥CPK28序列一致性为86.25%,与草莓FaCDPK1序列一致性为43.99%.表达分析显示该基因表达范围较广,在所分析的七种草莓组织材料中,以花中表达水平最高,在果实中的表达可能受成熟的诱导.     

FaesAP2B基因在甜荞长雌蕊长雄蕊突变体lpls的表达分析

为弄清甜荞（Fagopyrum esculentum Moench.）长雌蕊长雄蕊突变体lpls花和籽粒发育调控的分子机制,从甜荞中克隆出1个长1 788 bp的AP2同源基因的cDNA序列,命名为FaesAP2B（GenBank登录号为MK290847.1）。序列结构分析表明：FaesAP2B基因包含1个长1 380 bp的完整开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）,编码1个由459个氨基酸残基组成的AP2/ERF家族转录因子,该转录因子含有2个高度保守的AP2结构域,第1个AP2结构域前还存在1个由10个氨基酸残基组成的核定位信号区。用qPCR检测FaesAP2B基因在甜荞lpls突变体根、茎、幼叶、花被片、雄蕊、雌蕊以及发育4 d的果实共7种器官中表达的组织特异性显示：FaesAP2B在甜荞突变体lpls营养组织和生殖结构中均有表达,但其在花器官和果实等生殖结构中的表达量明显高于营养组织,且在雄蕊中的表达量最高,极显著高于其在其他6种组织中的表达量（LSD,P<0.01）,同时,FaesAP2B在花被片、雌蕊和发育4 d的果实中的表达量均极显著高于其在根、茎和叶等营养器官中的表达量（LSD,P<0.01）,但该基因在其根、茎、叶间的表达量无显著性差异。推测该基因可能主要参与调控甜荞lpls突变体花和果实的发育。     

Expression pattern of the pre-prothaumatin II gene under the control of the CaMV 35S promoter in transgenic cucumber (Cucumis sativus L.) flower buds and fruits

Thaumatin II is an extremely sweet-tasting protein produced by fruits of the West African shrubThaumatococcus daniellii Benth, so it can be used in biotechnology to improve the tastes of various plant products. This study is concerned with the spatial and temporal aspects of expression of the 35S-pre-prothaumatin II chimeric gene in flower buds and fruits of transgenic cucumber (Cucumis sativus L.) line 225. The activity of the 35S promoter in organs of line 225 was compared with its activity in 2 other transgenic lines. The accumulation of recombinant thaumatin varied spatially in flower bud tissues of transgenic lines. We found that these differences in the spatial accumulation of transgenic protein concerned the ovary of female buds and the perianth of male buds. In contrast to flower parts, recombinant thaumatin was found in nearly all parts of the young fruit from the transgenic plants. The pre-prothaumatin II gene expression was detected at a very early developmental stage in male buds, and its pattern was rather conserved as the buds aged. The expression of the transgene was also detected in vascular tissues of examined organs but was undetectable in pollen grains, in agreement with the generally held view that the CaMV 35S promoter is virtually silent in pollen. Immunocytochemical analyses of sections of control organs revealed endogenous homolog(s) of thaumatin when using polyclonal antisera, but not when using monoclonal antibodies for recombinant thaumatin detection in transgenic cucumber.     

Eucalyptus has functional equivalents of the Arabidopsis AP1 gene

Two Eucalyptus homologues of the Arabidopsis floral homeotic gene AP1 (EAP1 and EAP2/) show 60–65% homology to AP1. EAP1 and EAP2 are expressed predominantly in flower buds. EAP2 produces two different polypeptides arising from differential splicing at an intron, the shorter EAP2 protein diverging from the longer sequence after amino acid 197 and having a translation stop after residue 206. This truncated protein includes both MADS- and K-box amino acid sequences. Ectopic expression of the EAP1 or either of the two EAP2 polypeptides in Arabidopsis driven by the 35S promoter produces effects similar to the corresponding AP1 construct, causing plants to flower earlier, have shorter bolts and resemble the terminal flower mutant (tfl).     

The expression of tgas118, encoding a defensin in Lycopersicon esculentum, is regulated by gibberellin.

A flower specific cDNA, tgas118, has been isolated after differential screening of a gib-1 anther cDNA library of Lycopersicon esculentum. The corresponding mRNA was present in all tissues analysed. Northern blot analysis revealed that in wild-type tomato the gene was predominantly expressed throughout flower development, while in the gibberellin (GA)-deficient mutant of tomato (gib-1) the abundance declined. Treatment of the mutant with GA resulted in an accumulation of the tgas118 mRNA within hours in leaf and bud tissues. In the leaf, GA1, GA3 and GA9 were effective in enhancing the expression while GA4 was not. In addition to GA, wounding and dehydration also increased the accumulation of tgas118 mRNA in leaf tissue. In situ hybridization showed that application of 50 ng GA3 bud(-1) induced a similar spatial expression of the tgas118 mRNA in gib-1 buds 24 h post treatment to that found in wild-type flower buds. The deduced TGAS118 protein displays up to 77% similarity with defensins and as its expression is up-regulated by stimuli such as wounding it is proposed that it may play a role in protection against pathogens.     

Characterization of ethylene effects on sex determination in cucumber plants

Sex differentiation in cucumber plants (Cucumis sativus L.) appears to be determined by the selective arrest of the stamen or pistil primordia. We investigated the influence of an ethylene-releasing agent (ethephon) or an inhibitor of ethylene biosynthesis (aminoethoxyvinyl glycine) on sex differentiation in different developmental stages of flower buds. These treatments influence sex determination only at the stamen primordia differentiation stage in both monoecious and gynoecious cucumbers. To clarify the relationships between the ethylene-producing tissues and the ethylene-perceiving tissues in inducing female flowers in the cucumber, we examined the localization of mRNA accumulation of both the ACC synthase gene (CS-ACS2) and the ethylene-receptor-related genes (CS-ETR1, CS-ETR2, and CS-ERS) in flower buds by in situ hybridization analysis. CS-ACS2 mRNA was detected in the pistil primordia of gynoecious cucumbers, whereas it was located in the tissues just below the pistil primordia and at the adaxial side of the petals in monoecious cucumbers. In flower buds of andromonoecious cucumbers, only CS-ETR1 mRNA was detected, and was located in the pistil primordia. The localization of the mRNAs of the three ethylene-receptor-related genes in the flower buds of monoecious and gynoecious cucumbers overlap but are not identical. We discuss the relationship between the mRNA accumulation patterns and sex expression in cucumber plants.     

豆科AGAMOUS同源基因结构及功能分析

AGAMOUS(AG)基因是控制高等植物花发育的重要基因,已在20多种植物基因组中发现同源基因。作为MADS-box家族的一员,AG基因结构具有高度的保守性。AG及其同源基因在植物生长发育中的功能已经十分清晰。本文研究AG同源基因在豆科几个代表物种中的分布,对其基因结构和蛋白序列进行分析比对。结果表明,AG同源基因在不同的豆科物种中具有高度的序列同源性及结构保守性。进一步通过蒺藜苜蓿Medicago truncatula的AG同源基因表达模式分析发现,其表达是与功能相互验证的。