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相似文献
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1.
细菌采用II型脂肪酸系统合成脂肪酸,其中3-羟脂酰ACP脱水酶催化唯一的脱水反应,是细菌生长的关键酶之一.野油菜黄单胞菌(Xcc)引起几乎所有十字花科植物的黑腐病,在全球范围内造成广泛的经济损失.为研究Xcc中3-羟脂酰ACP脱水酶,本研究利用大肠杆菌3-羟脂酰ACP脱水酶FabZ序列同源比对时,发现其与XC_2876 (XcfabZ)编码蛋白具有同源性,序列一致性达到46.1%,同时还具有保守的α螺旋结构和活性位点.将XcfabZ异体遗传互补大肠杆菌fabZ(EcfabZ)条件突变株HW7,结果显示添加IPTG能恢复突变株的生长,初步表明XcFabZ具有3-羟脂酰ACP脱水酶活性.而体外活性分析显示,XcFabZ能在脂肪酸合成的起始反应和延伸反应中发挥3-羟脂酰ACP脱水酶活性作用.本研究不能直接获得XcfabZ基因敲除突变株,但将携带EcfabZ或XcfabZ的表达质粒导入后,获得基因替换突变株,证明XcfabZ是必需基因. EcfabZ替换突变株的脂肪酸组成与野生菌有差异,对逆境条件(高盐、低pH、H_2O_2和SDS)的耐受性显著下降,运动性也显著降低,但XcfabZ替换突变株恢复到野生菌水平,表明XcFabZ与EcFabZ虽然都具有3-羟脂酰ACP脱水酶活性,但在细胞中生理功能可能有一些差别.  相似文献   

2.
流产布氏杆菌烯脂酰ACP还原酶的鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
烯脂酰ACP还原酶是细菌脂肪酸合成的关键酶之一.流产布氏杆菌基因组有2个注释为烯脂酰ACP还原酶基因fabI的同源基因:fabI1fabI2.由这2个fabI同源基因编码的蛋白质分别与大肠杆菌FabI有50%和51%的同源性,且都拥有与大肠杆菌FabI一样的催化中心Tyr-(Xaa)6-Lys序列.分别用携带这2个同源基因的质粒载体转化大肠杆菌fabI温度敏感突变菌株JP1111.转化子能在42℃生长,表明这2个基因均能遗传互补大肠杆菌fabI突变,并使此菌株恢复脂肪酸的合成.另外,体外酶学分析显示,由这2个同源基因编码的蛋白质都拥有烯脂酰ACP还原酶活性,均能参与细菌脂肪酸合成.上述结果证实,流产布氏杆菌同时拥有2个同种类型的烯脂酰ACP还原酶,是一种新的烯脂酰ACP多样性的表现.  相似文献   

3.
【目的】硫辛酸是细胞内重要的辅因子,参与多种基础代谢过程。野油菜黄单胞菌(Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原菌,在全球范围内引起植物病害,引起重大经济损失。为此研究Xcc中硫辛酸的合成途径,为防治黑腐病提供新思路。【方法】利用大肠杆菌硫辛酸合成关键酶LipA和LipB序列,同源比对发现Xcc基因组中XC_0713 (XccLipA)和XC_0712 (XccLipB)具有较高的同源性。采用PCR方法分别扩增XccLipA和XccLipB基因,并连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌突变株,并检测转化子生长表型。利用同源重组方法,获得替换突变株,分析其生长性状,并利用剪叶法检测替换突变株对寄主植物甘蓝的致病力。【结果】XcclipA和XcclipB能分别恢复大肠杆菌lipA和lipB突变株在基础培养上生长。XcclipA和XcclipB都是菌体生长的必需基因,不能直接被敲除。但导入pSRK-EclplA后,成功分别获得XcclipA和XcclipB敲除突变株。两种EclplA替换后的敲除突变株在基础培养上都不能生长,添加硫辛酸后能恢复生长表型。在丰富培养基上,XcclipB敲除突变株能正常生长,而XcclipA敲除突变株不能生长,添加硫辛酸后生长也能恢复。分别测定不同培养条件下生长曲线,也得到同样的结果。寄主植物侵染结果显示,与野生菌相比,XcclipA敲除突变株致病性几乎丧失,而XcclipB敲除突变株的致病性与野生菌无显著性差异。【结论】Xcc中lipA编码硫辛酸合成酶,lipB编码辛酰转移酶,两者都是必需基因。Xcc中LipB-LipA途径是唯一的硫辛酰化途径,而没有外源性的硫辛酸途径。lipA敲除后显著影响Xcc的致病性,可作为抗菌药物筛选的靶点。  相似文献   

4.
3-酮基脂酰ACP还原酶催化3-酮基脂酰ACP还原为3-羟基脂酰ACP,是细菌脂肪酸合成反应的关键酶之一.为了明确该酶中110位的保守天冬酰胺残基在酶催化活性和酶结构中的作用,本研究采用基因定点突变和蛋白质表达纯化技术,获得了大肠杆菌3-酮基脂酰ACP还原酶FabG的两个突变蛋白:FabG N110Q和FabG N110L.圆二色谱结果显示,天冬酰胺残基的突变改变了FabG的空间结构,使突变蛋白的α螺旋结构明显增加.以3-酮脂酰ACP为底物的酶活性测定表明,突变蛋白的酶活性均有下降,但残存的酶活性达到了FabG的75%以上.突变蛋白FabG N110Q和FabG N110L具有3-酮基脂酰ACP还原酶的活性,能在体外重建细菌脂肪酸合成反应.对fabG温度敏感突变株的遗传互补分析表明,FabG蛋白110位天冬酰胺突变为谷氨酰胺或亮氨酸后,在一定的条件下仍能互补大肠杆菌的生长.本研究结果提示,FabG 110位的天冬酰胺残基不是参与3-酮基脂酰ACP还原酶催化反应的必需氨基酸,它只是作为结构氨基酸,在维持FabG的空间结构的稳定性方面起作用.  相似文献   

5.
大肠杆菌的FabB和FabF均具有长链3-酮基脂酰ACP合成酶活性.除参与长链饱和脂酰链的延伸外,FabB还是合成不饱和脂肪酸的关键酶之一,参与不饱和脂酰ACP的从头合成,最终生成顺-9-十六烯脂酰ACP.而FabF只能将顺-9-十六烯脂酰ACP延伸为顺-11-十八烯脂酰ACP,不参与不饱和脂酰ACP的从头合成.有研究表明,粪肠球菌、乳酸乳球菌、丙酮丁醇梭菌和茄科雷尔氏菌等细菌的FabF同源蛋白,具有类似大肠杆菌FabB和FabF的双功能.为证实该现象是否普遍存在,本研究选取了枯草芽孢杆菌BsfabF、中华苜蓿根瘤菌SmfabF、霍乱弧菌VcfabF、铜绿假单胞菌PafabF1和PafabF2 5个同源基因进行功能鉴定,体外酶学分析表明,5个FabF同源蛋白均具有长链3-酮基脂酰ACP合成酶活性,异体互补大肠杆菌CL28的脂肪酸组分分析显示,SmfabF、VcfabF、PafabF1和PafabF2具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅱ(FabF)活性,遗传互补大肠杆菌温度敏感突变株CY242和CY244的研究显示,仅有PafabF2编码的蛋白拥有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB)活性,能互补大肠杆菌fabB的突变.这表明不是所有的FabF同源蛋白均具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅰ和Ⅱ的双重活性.  相似文献   

6.
大肠杆菌(Escherichia coli)是Ⅱ型脂肪酸合成系统的模式生物,3-羟基脂酰ACP脱水异构酶(FabA)是不饱和脂肪酸合成中的关键酶.生物信息学分析表明,乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的基因组中没有标注为3-羟基脂酰ACP脱水异构酶的基因,但有两个标注为3-羟基脂酰ACP脱水酶基因LlfabZ1和LlfabZ2,其编码的蛋白质与EcFabZ的相似性分别为41%和45.1%,且都具有3-羟基脂酰ACP脱水酶两个保守的α螺旋结构.用携带LlfabZ1和LlfabZ2的质粒载体遗传互补大肠杆菌fabA温度敏感突变株CY57,在42℃下不能恢复生长,但无细胞抽提物的结果显示LlFabZ1能够使反-2-癸烯酰ACP异构成顺-3-癸烯酰ACP,而LlFabZ2则不能.互补大肠杆菌fabZ突变株HW7显示,在诱导的条件下,含有LlfabZ2的转化子能够恢复生长,而LlfabZ1则不能.体外重建脂肪酸合成反应及蛋白质活性测定表明,LlFabZ1具有3-羟基脂酰ACP脱水异构酶功能,而LlFabZ2只具有3-羟基脂酰ACP脱水酶功能.另外,未得到LlfabZ1和LlfabZ2的突变株,表明LlFabZ1和LlFabZ2可能是乳酸乳球菌脂肪酸合成酶系中的必不可少的关键蛋白.上述结果证实了乳酸乳球菌fabZ1和fabZ2两个基因在脂肪酸合成中的功能.  相似文献   

7.
【背景】链霉菌属于放线菌科,在土壤环境中广泛分布。链霉菌具有复杂的形态分化和多样性的次生代谢网络,能产生大量具有生物活性的次级代谢产物,被广泛深入研究。【目的】天蓝色链霉菌是链霉菌的模式菌株,其脂肪酸合成代谢与次级代谢联系紧密,但目前脂肪酸合成代谢途径还不清楚,其长链3-酮脂酰ACP合成酶还未见报道。【方法】利用大肠杆菌FabF序列进行同源比对,发现天蓝色链霉菌A3(2)的基因组中,SCO2390(ScoFabF1)、SCO1266(ScoFabF2)、SCO0548(ScoFabF3)和SCO5886 (ScoRedR)具有较高的相似性,并具有保守的Cys-His-His催化活性中心,可能具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性。采用PCR扩增方法分别获得以上基因,连入表达载体pBAD24M后分别互补大肠杆菌fabB(ts)突变株和fabB(ts)fabF双突变株,并检测转化子的生长情况。以上基因与pET-28b连接后,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,并利用Ni-NTA纯化获得蛋白,体外测定其催化活性。将以上基因分别互补大肠杆菌fabF突变株后,GC-MS测定互补株的脂肪酸组成。【结果】4个同源基因中,只有ScofabF1能恢复fabB(ts)fabF双突变株42°C时在添加油酸条件下的生长,其他3个基因均不能恢复生长。而这4个基因都不能恢复fabB(ts)突变株42°C时生长。体外活性测定ScoFabF1具有长链3-酮脂酰ACP合成酶活性,其他3个蛋白都不具有该活性。仅ScofabF1能显著提高大肠杆菌fabF突变株的顺-11-十八碳烯酸(C18:1)比例,其他3个基因都不具有该功能。【结论】天蓝色链霉菌中ScofabF1编码长链3-酮脂酰ACP合成酶II,在脂肪酸利用过程中发挥重要作用。天蓝色链霉菌中没有发现编码长链3-酮脂酰ACP合成酶I的基因,其可能通过其他途径合成少量的不饱和脂肪酸。以上研究结果为进一步研究天蓝色链霉菌中脂肪酸合成机制奠定了基础。  相似文献   

8.
3-酮脂酰ACP还原酶(FabG)催化脂肪酸合成中的第一步还原反应,是细菌生长的关键酶之一.恶臭假单胞菌在环境污染治理和工业聚羟基脂肪酸(PHA)的生产中,都具有重要的应用价值.生物信息学分析显示,恶臭假单胞菌基因组编码6个FabG同源蛋白质,与大肠杆菌FabG相比较,PpFabG5序列相似性最高(76.5%),其他几个PpFabG也都具有较高的序列相似性(约50%).除PpFabG4之外,其他的同源蛋白质都具有催化活性位点和N端辅因子结合位点.为研究恶臭假单胞菌中这6个FabG同源蛋白质的生物学功能,本文进行了异体遗传互补、体外酶学活性分析、体内基因敲除与突变株性状分析等研究.结果显示,只有PpfabG1、PpfabG3、PpfabG5能恢复大肠杆菌fabG温度敏感突变株CL104在42℃时生长,其中PpfabG1互补株生长较弱.而在体外活性检测中,PpFabG1、PpFabG3和PpFabG5在脂肪酸合成起始反应和延伸反应中都具有催化活性,但PpFabG1活性较弱,PpFabG6仅在起始反应中具有催化活性. PpfabG5是恶臭假单胞菌生长的必需基因,不能被敲除,而其他几个PpfabG基因敲除后不影响菌体的生长,突变株的脂肪酸组成与野生菌也无差异.但PpfabG1、PpfabG2敲除后菌体的运动性下降,PpfabG3、PpfabG6突变影响了生物被膜的合成量,而PpfabG4、PpfabG6敲除突变株对H2O2的耐受性增强,表明这些基因具有不同的生理功能,可能在菌体的不同逆境中发挥作用.  相似文献   

9.
FabB和FabF是大肠杆菌(Escherichia.coli)脂肪酸合成的关键酶.生物信息学分析显示,粪肠球菌基因组中有2个与大肠杆菌fabF同源的基因:fabF1和fabF2,缺少与fabB同源的基因.用粪肠球菌(Enterococcus faecalis)V583总DNA为模板,PCR扩增fabF1和fabF2基因,以pBAD24为载体,构建了重组质粒pHW13(fabF1)和pHW14(fabF2).体内体外研究显示:fabF1基因能互补大肠杆菌fabB突变,FabF1具有β酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB)活性;fabF2能互补大肠杆菌fabF突变,FabF2具有β酮脂酰ACP合成酶Ⅱ(FabF)活性.同时发现粪肠球菌FabF2不同于大肠杆菌FabF,它还拥有微弱β酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB)活性,可使大肠杆菌fabB突变株产生少量的不饱和脂肪酸.上述结果表明,FabF类酶(FabF like enzyme)同样可以具有β酮脂酰ACP合成酶Ⅰ(FabB)活性.  相似文献   

10.
不同细菌来源的3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ生物学特性分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ(FabH)是催化细菌脂肪酸合成的起始反应.研究表明,革兰氏阳性细菌FabH对支链脂酰-CoA前体的选择性是其合成支链脂肪酸的关键.但部分革兰氏阴性细菌也产生一定量的支链脂肪酸,其合成机制还不清楚.为此,本研究选取了革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌BsfabH1和BsfabH2、金黄色葡萄球菌SafabH、天蓝色链霉菌ScofabH、革兰氏阴性细菌茄科雷尔氏菌RsfabH、大肠杆菌EcfabH,以及产支链脂肪酸的水稻黄单胞菌XoofabH,共7种fabH同源基因进行生物学特性分析.异体遗传互补茄科雷尔氏菌fabH突变株RsmH,表明这7个基因编码蛋白都具有3-酮脂酰ACP合成酶Ⅲ活性.脂肪酸组成分析显示,4个革兰氏阳性菌fabH和XoofabH互补株类似,均能产生支链脂肪酸,而EcfabH和RsfabH互补株不产生支链脂肪酸,说明XooFabH不同于EcFabH,参与支链脂肪酸合成.体外酶学分析表明,XooFabH与4种革兰氏阳性菌FabH类似,对支链脂酰-CoA有较高的选择,但EcFabH和RsFabH对支链前体活性低.与革兰氏阳性细菌FabH不同,XooFabH对中短链长(C4~C10)脂酰-CoA也具有较高的活性.综合以上结果,不同细菌来源FabH的生物学特性差异明显,FabH能利用支链前体是细菌合成支链脂肪酸的关键因素.  相似文献   

11.
【背景】野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)引起十字花科植物黑腐病,在全球范围内造成经济损失,亟须深入研究其致病机理,开发新的黑腐病防控措施。细菌脂肪酸合成系统不仅为细胞膜合成提供原料,其中间代谢产物还是许多生物活性分子合成的底物,具有重要的生理功能,也是抗菌药物筛选的重要靶标。【目的】研究Xcc fabZ对扩散信号分子(diffusible signal factor,DSF)类信号产量、致病力、胞外酶、胞外多糖和运动性等方面的影响。【方法】利用报告菌株检测法分析了不同替换突变株的DSF类群体感应信号产量。利用同源重组原理,在DSF类信号高产菌株中获得替换突变株,利用高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)法测定DSF类信号产量。利用剪叶法检测替换突变株对寄主植物甘蓝的致病力,并分析了不同菌株的胞外多糖、胞外酶和运动性差异。【结果】报告菌株检测法和HPLC法都证明大肠杆菌fabZ替换突变株(Xcc ΔfabZ/pSRK-Ec fabZ)中DSF类信号产量显著下降。而该突变株对寄主植物的致病性也下降,在白菜提取物中生长也变慢,胞外酶产量下降,运动性也变弱。而Xcc fabZ替换突变株的DSF类信号产量恢复到野生菌水平,且过量产生胞外多糖使得致病性增强,胞外酶、运动性也都有所恢复。【结论】Xcc中3-羟基脂酰ACP脱水酶(FabZ)与其致病性相关,不仅影响DSF类信号产量,还在胞外酶、运动性等方面发挥作用。  相似文献   

12.
Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc), the causal agent of black rot in crucifers, produces a membrane-bound yellow pigment called xanthomonadin to protect against photobiological and peroxidative damage, and uses a quorum-sensing mechanism mediated by the diffusible signal factor (DSF) family signals to regulate virulence factors production. The Xcc gene XCC4003, annotated as Xcc fabG3, is located in the pig cluster, which may be responsible for xanthomonadin synthesis. We report that fabG3 expression restored the growth of the Escherichia coli fabG temperature-sensitive mutant CL104 under non-permissive conditions. In vitro assays demonstrated that FabG3 catalyses the reduction of 3-oxoacyl-acyl carrier protein (ACP) intermediates in fatty acid synthetic reactions, although FabG3 had a lower activity than FabG1. Moreover, the fabG3 deletion did not affect growth or fatty acid composition. These results indicate that Xcc fabG3 encodes a 3-oxoacyl-ACP reductase, but is not essential for growth or fatty acid synthesis. However, the Xcc fabG3 knock-out mutant abolished xanthomonadin production, which could be only restored by wild-type fabG3, but not by other 3-oxoacyl-ACP reductase-encoding genes, indicating that Xcc FabG3 is specifically involved in xanthomonadin biosynthesis. Additionally, our study also shows that the Xcc fabG3-disrupted mutant affects Xcc virulence in host plants.  相似文献   

13.
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In this study we describe a novel gene, which was isolated in an attempt to search for specific plant resistance genes of Arabidopsis against isolates of the phytopathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris. The gene was cloned by differential screening of a genomic library of the Xcc 750-resistant ecotype Col-0, using cDNA populations derived from ecotype Col-0 and the Xcc 750-susceptible ecotype Oy-0. The isolated gene, CXc750, is differentially expressed in ecotypes of Arabidopsis thaliana. In addition, although highly expressed in uninfected plants, gene expression increases in response to pathogen attack. CXc750 potentially codes for a small, basic protein of about 10 kDa. The predicted protein product contains a potential signal leader peptide at the amino-terminal end but no ER retention sequence and no further transmembrane domain. This indicates that the gene product is transported to other compartments or out of the cell.The possible function of CXc750 as a member of the plant defense response system is discussed.  相似文献   

15.
[目的] 植物病原细菌通过III型分泌系统(type III secretion system,T3SS)将III型效应物(type III secreted effectors,T3SEs)分泌转运到宿主细胞的不同位点上,进而行使不同的致病功能。本研究旨在确定Xcc 8004 III型效应物中分子量最大的蛋白XopXccR1在植物中的亚细胞定位。[方法] 利用生物信息学方法分析XopXccR1的跨膜信息。通过同源重组方法将XopXccR1全长、N端(1–1220 aa)和C端(1221–2030 aa)分别克隆到植物表达载体pCAMBIA-2300-35S::EGFP上,利用根癌农杆菌介导的瞬时表达浸染本生烟,通过激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位结果。[结果] XopXccR1全长和N端定位在本生烟细胞膜上,而C端定位在细胞质中。[结论] XopXccR1的N端与C端可能分别存在定位信号,N端信号主导全长蛋白的最终定位。  相似文献   

16.
Summary The recent placement of major Gramnegative prokaryotes (Superfamily B) on a phylogenetic tree (including, e.g., lineages leading toEscherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, andAcinetobacter calcoaceticus) has allowed initial insights into the evolution of the biochemical pathway for aromatic amino acid biosynthesis and its regulation to be obtained. Within this prokaryote grouping,Xanthomonas campestris ATCC 12612 (a representative of the Group V pseudomonads) has played a key role in facilitating deductions about the major evolutionary events that shaped the character of aromatic biosynthesis within this grouping.X. campestris is likeP. aeruginosa (and unlikeE. coli) in its possession of dual flow routes to bothl-phenylalanine andl-tyrosine from prephenate. Like all other members of Superfamily B,X. campestris possesses a bifunctional P-protein bearing the activities of both chorismate mutase and prephenate dehydratase. We have found an unregulated arogenate dehydratase similar to that ofP. aeruginosa inX. campestris. We separated the two tyrosine-branch dehydrogenase activities (prephenate dehydrogenase and arogenate dehydrogenase); this marks the first time this has been accomplished in an organism in which these two activities coexist. Superfamily B organisms possess 3-deoxy-d-arabino-heptulosonate 7-P (DAHP) synthase as three isozymes (e.g., inE. coli), as two isozymes (e.g., inP. aeruginosa), or as one enzyme (inX. campestris). The two-isozyme system has been deduced to correspond to the ancestral state of Superfamily B. Thus,E. coli has gained an isozyme, whereasX. campestris has lost one. We conclude that the single, chorismate-sensitive DAHP synthase enzyme ofX. campestris is evolutionarily related to the tryptophan-sensitive DAHP synthase present throughout the rest of Superfamily B. InX. campestris, arogenate dehydrogenase, prephenate dehydrogenase, the P-protein, chorismate mutase-F, anthranilate synthase, and DAHP synthase are all allosteric proteins; we compared their regulatory properties with those of enzymes of other Superfamily B members with respect to the evolution of regulatory properties. The network of sequentially operating circuits of allosteric control that exists for feedback regulation of overall carbon flow through the aromatic pathway inX. campestris is thus far unique in nature.  相似文献   

17.
Cyclic guanosine 3′,5′‐monophosphate (cyclic GMP) is a second messenger whose role in bacterial signalling is poorly understood. A genetic screen in the plant pathogen Xanthomonas campestris (Xcc) identified that XC_0250, which encodes a protein with a class III nucleotidyl cyclase domain, is required for cyclic GMP synthesis. Purified XC_0250 was active in cyclic GMP synthesis in vitro. The linked gene XC_0249 encodes a protein with a cyclic mononucleotide‐binding (cNMP) domain and a GGDEF diguanylate cyclase domain. The activity of XC_0249 in cyclic di‐GMP synthesis was enhanced by addition of cyclic GMP. The isolated cNMP domain of XC_0249 bound cyclic GMP and a structure–function analysis, directed by determination of the crystal structure of the holo‐complex, demonstrated the site of cyclic GMP binding that modulates cyclic di‐GMP synthesis. Mutation of either XC_0250 or XC_0249 led to a reduced virulence to plants and reduced biofilm formation in vitro. These findings describe a regulatory pathway in which cyclic GMP regulates virulence and biofilm formation through interaction with a novel effector that directly links cyclic GMP and cyclic di‐GMP signalling.  相似文献   

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