红松ISSR-PCR实验系统影响因素

本文探讨了红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.)ISSR实验中的各种影响因素,分别对红松的鲜叶、干叶、胚和胚乳4种材料进行了DNA的提取和PCR扩增,证明4种取样方式都是可行的.另外分析了模板的纯度和浓度、dNTP浓度以及TaqDNA聚合酶的浓度等对ISSR-PCR扩增的影响;尝试了不同的退火温度、延伸时间和循环次数,筛选出17个扩增稳定且多态性丰富的ISSR引物;建立了红松ISSR的最佳反应体系,为进行红松种群间遗传分化的研究奠定基础.     

桦树ISSR-PCR反应体系的优化

以桦树(Betula)DNA为材料,分析了DNA浓度;TagDNA聚合酶用量及退火温度对ISSR—PCR扩增结果的影响,筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的17个ISSR引物,建立了稳定的、可重复的桦树ISSR-PCR最佳反应体系及PCR扩增参数,为今后利用ISSR标记技术开展桦树种间遗传多样性分析提供一个标准化程序。     

叉孢苏铁ISSR反应条件的优化及初步应用

利用ISSR 技术对叉孢苏铁(Cycas segmentifida)遗传多样性进行研究,对影响PCR 反应的DNA 模板浓度、dNTP 浓度、Taq 酶含量、引物浓度、Mg2 浓度和退火温度等进行了条件优化。叉孢苏铁的ISSR 最佳反应扩增体系为20μl 反应体积2μl 10 ×PCR buffer,模板DNA20ng,1UTaq 酶,1.5～2.75mmol/L MgCl2,0.1mmol/L 4 ×dNTP,0.22μmol/L 引物,2%甲酰胺。适宜的退火温度为50～52℃。从103 条引物中筛选出12 条用于所有样品的扩增,共扩增出122 条带,其中多态性条带为86 条,占总条带数的70.49%。POPGENE分析结果表明,种级水平上,叉孢苏铁具有中等稍高的遗传多样性水平,且各居群间有着很高的遗传分化度。     

紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

以紫云英为研究材料,用哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物和11种株系紫云英品种的DNA为模板进行PCR扩增,筛选出33条扩增条带较好的ISSR引物,对其中的ISSR引物进行梯度PCR,筛选出最佳的退火温度。再采用正交试验和单因素试验相结合的方法对紫云英ISSR-PCR反应体系的5种因素(模板、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化浓度。确立了适合紫云英的ISSR分析的反应体系。在25μl反应体系中,其反应浓度为:DNA模版50.00ng,Mg2+2.00mol/L,Taq聚合酶1.0 U,dNTP 0.25mmol/L,引物0.20μmol/L,2.5μl 10×buffer。本试验为以后利用ISSR技术进行紫云英遗传多样性分析和物种保护奠定了技术基础。     

均匀设计优化建兰ISSR-PCR体系

采用均匀设计,对影响建兰ISSR-PCR体系的引物、Mg^2＋、dNTP和Taq DNA聚合酶浓度等进行4因素5水平和4因素3水平两轮优化,建立了适合于建兰ISSR-PCR的反应体系：在20μL反应体系中,舍引物0．25μmol／L、Mg^2＋ 2．5mmol／L,dNTP0．2mmol／L、Taq DNA聚合酶1.5U和模板DNA40ng．在此基础上对扩增程序中的循环次数和退火温度,以及ISSR引物进行筛选．筛选获得的扩增程序为：94℃预变性5min;接着进行32个循环：94℃变性35S,52～56℃退火45S,72℃延伸90s;循环结束后,72℃延伸10min．同时筛选得到14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物．     

SRAP、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用

将SRAP与ISSR 2种分子标记技术应用于8种甘蓝类植物（Brassica oleracea L.）的种子鉴别中。先以甘蓝（Brassica oleracea var. capitata）基因组DNA为模板,通过对SRAP、ISSR反应体系中各影响因素的逐一筛选,优化了甘蓝类植物SRAP、ISSR反应体系。进而采用30个SRAP引物组合和15个ISSR引物对白甘蓝、皱叶甘蓝、红甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝的基因组DNA进行了PCR扩增,结果表明：M3E5与M4E5两个SRAP引物组合可以在8种甘蓝类植物之间显示较高的多态性;844和888两个ISSR引物也可在8种甘蓝类植物之间产生很好的多态,特别是844引物单独应用即可区分所有材料。     

不同龙眼资源遗传多样性的SCoT和ISSR 比较分析

应用SCoT和ISSR标记对36份龙眼资源和1份近缘种龙荔的遗传多样性进行分析。结果表明:12对SCoT引物共扩增出127条带,平均每条引物扩增10.58条带;15条ISSR引物共扩增出117个条带,平均扩增7.8条带。UPGMA聚类结果表明:SCoT标记和ISSR标记分别在相似系数0.672和0.685水平上,均可将37份材料分成6大类群,SCoT和ISSR标记均适用于龙眼材料的遗传多样性分析,如果将两种标记的数据进行综合分析,可以缩小单一标记的误差。研究结果为龙眼种质资源的保存和利用提供了重要的依据。     

酚酸物质对红松种子萌发及苗木生长和生理特性的影响

通过室内模拟试验,阐明阔叶红松林中已测得含量较高的3种酚酸物质（苯甲酸、丁香酸和香草酸）对红松种子萌发及苗木生长的影响,为探索阔叶红松林内化感作用机理及解决红松更新障碍问题提供科学依据。采用培养皿培养法及室内盆栽培养法,以红松种子和3年生红松苗为试验对象,设置不同浓度（2、20、200 mg/L）苯甲酸、丁香酸、香草酸处理液,以蒸馏水为对照（CK）,进行红松种子萌发试验及红松苗木生长试验,研究3种酚酸物质对红松种子发芽、苗木生长、光合色素、抗氧化酶活性、膜脂过氧化作用及渗透调节物质的影响。结果表明,（1）不同浓度3种酚酸均抑制红松种子萌发,但酚酸浓度变化仅对红松种子发芽率影响差异显著。（2）3种酚酸对红松苗木生长及物质积累抑制作用显著。浓度变化对红松苗株高及地径影响不显著,对生物量、根干重和茎干重影响显著。（3）针叶叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量变化对酚酸处理反应一致,20 mg/L的3种酚酸均显著抑制光合色素产生,而200 mg/L丁香酸溶液及2 mg/L香草酸溶液均显著促进叶绿素a和类胡萝卜素积累。（4）酚酸处理使红松苗针叶中POD、CAT活性降低,SOD活性增加。针叶中MDA含量显著增加,200 mg/L丁香酸溶液处理组针叶MDA含量高于CK处理组70.51%。（5）不同浓度苯甲酸溶液促进可溶性糖增加,抑制可溶性蛋白增加;不同浓度丁香酸溶液促进可溶性蛋白增加,而不同浓度香草酸溶液抑制可溶性蛋白增加,二者对可溶性糖含量影响受浓度变化影响显著。苯甲酸、丁香酸、香草酸影响红松种子萌发,通过对红松苗光合色素、抗氧化酶活性及渗透调节物质的影响导致其生长受抑制、生物量减少,产生膜脂过氧化伤害。因此,解决阔叶红松林内红松更新障碍问题时,凋落物及土壤中酚酸物质的化感作用不容忽视。     

狭边大叶藓（Rhodobryum ontariense）ISSR-PCR反应体系的建立与优化

研究目的是获得适用于狭边大叶藓（Rhodobryum ontariense）遗传多样性研究的ISSR—PCR反应标准化程序。通过单因素试验设计,对Mg^2＋、dNTPs、Taq DNA聚合酶、模板、引物浓度,以及退火温度、循环次数等影响ISSR扩增的主要因素进行了研究和优化。结果表明,UBC808、UBC811、UBC812、UBC825、UBC826、UBC841、UBC888及UBC891引物适用于该研究;20μL ISSR—PCR最适反应体系包括：6ngDNA模板、0．4μmol／L引物、2．25mmoL／LMg^2＋、0．6U Taq DNA聚合酶、0．4mmol／LdNTPs。扩增程序为：94℃预变性4min;然后94℃变性1min,48～50℃（根据不同引物确定）复性2min,72℃延伸1min,共进行40个循环;最后,72℃延伸7min,4℃保存。     

正交设计优化绿竹ISSR-PCR体系和引物筛选

旨在建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序,并筛选适于绿竹ISSR-PCR分析的高多态性引物。以绿竹基因组DNA为ISSR-PCR扩增模板,采用正交试验方法,对d NTPs浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、模板DNA用量设计5因素4水平试验,采用极差分析法和方差分析法对试验结果进行分析。并对退火温度和循环次数进行筛选,建立绿竹ISSR-PCR最佳反应体系和扩增程序。并利用优化后的体系对100条ISSR引物进行筛选。最终确定的最佳反应体系为:20μL的扩增体系中,d NTPs浓度为0.2 mmol/L,Mg~(2+)浓度为2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶浓度为1.5 U,引物浓度为0.4μmol/L,DNA浓度为60 ng,10×PCR Buffer体积为2μL、剩下用灭菌ddH_2O补全。各因素影响大小依次是:Mg~(2+)d NTPs模板DNATaq DNA聚合酶引物。扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s,(根据引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸90 s,循环38次,72℃延伸10 min,4℃保存。以此体系为基础进行引物筛选,在100条ISSR引物中筛选出14条扩增条带清晰、多态性较高、重复性好的引物。     

Analyzing genetic relationships in Bombyx mori using intersimple sequence repeat amplification

Intersimple sequence repeat (ISSR) amplification was used to analyze genetic relationships among silkworm, Bombyx mori L., strains. Nineteen primers containing simple sequence repeat (SSR) motifs were tested for amplification on a panel of 42 strains, representative of the diversity of silkworm germplasm; 12 of the primers amplified distinct, reproducible bands. The primers amplified a total of 108 bands, of which 85 (78.7%) were polymorphic. The ISSR results suggested that within the dinucleotide class, the poly(CA) motif was more common than the poly(CT) motif. The ISSR amplification pattern was used to group the silkworm strains into seven subclusters based on their origin in an unweighted pair-group method with arithmetic average cluster analysis by using Nei's genetic distance. Seven major ecotypic silkworm groups were analyzed. Principal component analysis of the ISSR data supported the unweighted pair-group method with arithmetic average clustering. Therefore, ISSR amplification is a valuable method for determining genetic variability among silkworm varieties. This efficient genetic fingerprinting technique should be useful for characterizing the large numbers of silkworm strains held in national and international germplasm centers.     

阔叶红松林生态化学计量学特征及其对纬度梯度的响应

为研究红松叶片的养分及生态化学计量学特征的空间分布及其影响因素,依据我国温带阔叶红松林的分布特点,沿纬度梯度,选取长白山(42°27'N)、张广才岭(44°16'N)和小兴安岭(48°05'N)等3个地区的典型阔叶红松老龄林,测定红松叶片碳(C)、氮(N)、磷(P)含量,及表层土壤(0—15 cm)、中层土壤(15—30 cm)的有机碳(SOC)、全氮(TN)和全磷(TP)含量,分析了其分布特征及其相互关系。结果表明:1)红松叶片C、N、P含量显著高于土壤。表层土壤C、N、P含量变化范围分别为27.6—87.4,2.0—7.2 mg/g和0.26—0.92 mg/g;中层土壤为8.1—59.7,0.7—4.6 mg/g和0.2—0.82 mg/g;而叶片为495.5—507.4,12.7—172.5 mg/g和1.1—2.1 mg/g。2)土壤中的SOC、C/N、C/P均随纬度升高极显著增加,而叶片各元素计量特征随纬度的变化不显著。3)叶片N、P含量分别与土壤N、P含量显著正相关,同时,叶片N与土壤C/N、P与土壤N/P显著相关。相比较而言,红松叶片N、P含量较低,这可能说明阔叶红松林土壤N、P供应不足,而叶片N/P仅为9.9,说明东北阔叶红松林N限制更加明显。本研究为阐明东北温带阔叶红松林的养分供应状况和限制因素,为阔叶红松林区提高红松生产力的管理措施的提出奠定了基础。     

长白山阔叶红松林带内杨桦林动态模拟

利用改进的ZELIG .CBA模型模拟了长白山杨桦林的动态变化过程 .根据红松种源的存在与否 ,将模拟分为两种方案 ,结果表明 ,红松参加演替与否决定了山杨、白桦退出林分时间的早晚 ;红松种源存在时 ,演替的最终结果是阔叶红松林 ;无红松种源时 ,演替的最终结果是阔叶混交林 ,两种林分的生物量和蓄积量相差很大     

凉水自然保护区不同皮型红松径向生长对气候的响应

运用相关函数及单年分析等树木年轮气候学方法,研究了黑龙江凉水国家自然保护区不同皮型红松径向生长与气候因子的关系、主要影响因子及这种响应关系是否长期稳定.结果表明: 细皮红松更适合做树木年轮气候学分析.两种皮型红松的径向生长对环境变化都比较敏感,对气候因子的响应无显著差异.1902—2009年生长季,尤其当年6月的气候因子是影响研究区两种皮型红松生长的主要因子.其中,温度表现为显著负相关,降水表现为显著正相关.不同时间段内红松径向生长对气候因子的响应存在差异,随着1970年后气温的快速升高及干旱的加剧,两种皮型红松径向生长对气候因子的响应更敏感,尤其表现为对生长季温度和更多季节水热复合因子变化（帕尔默干旱指数）的响应更显著.
     

不同光强下红松幼树光合作用和营养物质含量的季节模式

一、前言原始红松林下幼树生长缓慢,死亡率高,若干文献通过与桦木林光照和水热条件的对比观察,认为光是影响生长的主要原因。但同时也发现,在植物一切代谢活动最旺盛的生长季(6—9月),上述二种林下的光强(lx)     

长白山阔叶红松林演替序列水分利用效率特征

水分利用效率是反映植物水分利用的客观指标,对其研究有助于了解陆地生态系统的碳水耦合机制。本研究利用稳定碳同位素技术分析了长白山阔叶红松林演替序列下3种林分(中龄杨桦林、成熟杨桦林、阔叶红松林)中优势树种的水分利用效率。结果表明: 3种林分的水分利用效率在不同演替阶段存在阔叶红松林＞中龄杨桦林＞成熟杨桦林的大小顺序,且同一树种在不同林分中水分利用效率不同,中龄杨桦林中山杨和白桦的水分利用效率高于成熟杨桦林,阔叶红松林中水曲柳的水分利用效率远高于其在中龄杨桦林,阔叶红松林中色木槭和蒙古栎的水分利用效率高于其在成熟杨桦林;优势树种的水分利用效率存在木材类型上的差异,总体呈现环孔材树种＞散孔材树种;阔叶红松林优势树种中,阔叶树种和针叶树种的水分利用效率在生长季呈现两种不同的变化趋势,水曲柳、色木槭、蒙古栎、紫椴总体呈现先减小后增加的趋势,而红松呈现先增加后减小的趋势。生长季阔叶红松林的水分利用效率与温度呈显著负相关。不同的水分利用效率是长白山阔叶红松林优势树种适应演替进程、响应气候和环境变化的策略之一。     

Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice (Oryza sativa L.)

 Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification was used to analyze microsatellite motif frequency in the rice genome and to evaluate genetic diversity among rice cultivars. A total of 32 primers, containing different simple sequence repeat (SSR) motifs, were tested for amplification on a panel of 59 varieties, representative of the diversity of cultivated rice (Oryza sativa L.). The ISSR analysis provided insights into the organization, frequency and levels of polymorphism of different simple sequence repeats in rice. The more common dinucleotide motifs were more amenable to ISSR analysis than the more infrequent tri-, tetra- and penta-nucleotide motifs. The ISSR results suggested that within the dinucleotide class, the poly(GA) motif was more common than the poly(GT) motif and that the frequency and clustering of specific tri- and tetra-nucleotide simple sequence repeats was variable and motif-specific. Furthermore, trinucleotide ISSR markers were found to be less polymorphic than either dinucleotide or certain tetranucleotide ISSR markers, suggesting which motifs would be better targets for microsatellite marker development. The ISSR amplification pattern was used to group the rice genotypes by cluster analysis. These results were compared to surveys of the same varieties for amplified fragment length polymorphism (AFLP), restriction fragment length polymorphism (RFLP) and isozyme markers. The ISSR fingerprint could be used to differentiate the genotypes belonging to either Japonica or Indica sub species of cultivated rice and to dissect finer levels of diversity within each subspecies. A higher percentage of polymorphic bands was produced with the ISSR technique than the AFLP method, based on a similar PCR reaction. Therefore, ISSR amplification proved to be a valuable method for determining genetic variability among rice varieties and for rapidly identifying cultivars. This efficient genetic fingerprinting technique would be useful for characterizing the large numbers of rice accessions held in national and international germplasm centers. Received: 25 May 1998 / Accepted: 17 September 1998     

长白山阔叶红松林不同演替阶段土壤团聚体粒径组成及有机碳含量变化

阔叶红松林是我国东北重要的原生群落,其土壤团聚体在森林生态系统碳固定中具有重要作用.本研究采用空间代替时间的方法,选取白桦幼龄林、白桦中龄林、白桦成熟林、阔叶红松成熟林和阔叶红松过熟林5个不同演替序列,通过湿筛法研究长白山天然针阔混交林群落恢复演替中土壤团聚体粒径组成及有机碳含量的变化.结果表明: 土壤团聚体粒径组成受演替过程影响较大,不同演替阶段下土壤团聚体各粒级所占比例差异显著.团聚体平均质量直径随演替的进行表现为先升高再降低的单峰形式,且最高点出现在白桦成熟林阶段.土壤中不同粒级的团聚体内有机碳含量随着演替的进行呈先增加后略有下降的趋势,且团聚体内有机碳含量最大值出现在阔叶红松成熟林阶段.在同一演替阶段下,0～5和5～10 cm土层(除演替末期的阔叶红松过熟林外)中的各粒径团聚体内有机碳含量都随着粒径的减小而增加,而10～20 cm土层中的各粒径团聚体内有机碳含量都随着粒径的减小而减小.从演替初期的白桦幼龄林到演替末期的阔叶红松过熟林,每个样地内的同一粒径团聚体内有机碳含量均具有明显的垂直分布特性,均随着土层深度的增加而显著降低.     

濒危植物夏蜡梅ISSR扩增条件的优化

为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性,有必要进行ISSR-PCR反应体系的优化。以濒危植物夏蜡梅的基因组DNA为研究对象,利用单因素试验,测试了ISSR-PCR反应体系中镁离子,dNTP,模板DNA含量,Taq DNA聚合酶量、BSA浓度、引物浓度、甘油浓度等7种因素对反应结果的影响,经过优化实验,建立了夏蜡梅ISSR-PCR最佳反应体系：10 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液（10 mmol·L^-1 Tris·HCl pH9.0,50 mmol·L^-1 KCl, 0.1%Triton X-100）,1.5 mmol·L^-1 MgCl₂,0.75U Taq酶（上海华美公司）,20 ng模板DNA,6pmol引物（上海Sangon公司）;dATP、dCTP 、dGTP 、dTTP 各0.15 mmol·L^-1。利用优化反应体系从100个ISSR引物中共筛选出12个稳定性好、重复性高的引物,对10个居群共200个夏蜡梅个体的DNA进行扩增,共扩增出156个条带,其中多态条带为114个,总的多态位点百分率为73.08%。各居群的多态位点百分率有较大差异,平均为23.65%。夏蜡梅ISSR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究夏蜡梅的遗传多样性奠定了良好的基础。