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1.
蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的表面展示及酶学性质分析   总被引:1,自引:0,他引:1  
【目的】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶催化1分子蔗糖上的果糖基转移到另一个蔗糖分子上,形成1-蔗果三糖和葡萄糖。在低聚果糖中,1-蔗果三糖益生素活性最高。本研究将该酶展示在酵母菌细胞表面上,并用于1-蔗果三糖的制备。【方法】将来自莴苣的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶基因克隆到用于酵母细胞表面展示的表达载体上,并在解脂亚罗酵母菌中进行异源表达,表达的酶展示在该细胞表面上,然后以蔗糖为底物,研究表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶的性质。【结果】免疫荧光实验结果表明蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶已展示在酵母菌的细胞表面上,高效液相色谱结果表明酵母表面展示的该酶具有转移酶的催化活性。该酶的最适作用温度、最适作用p H分别为45°C和7.5;该酶的催化活性受Zn2+和Cu2+的抑制,受Ca2+激活;该酶重复使用7次后,酶活下降50%。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶和3%蔗糖混合后在40°C条件下孵育30 min后,所产1-蔗果三糖含量最高为20.8 mmol/L。【结论】蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶在解脂亚罗酵母菌中得到成功表达,并展示在其细胞表面上,生化研究表明该重组蛋白具有果糖基转移酶活性,且催化蔗果三糖的生成。表面展示的蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶作为一种全细胞催化剂能够用于1-蔗果三糖的制备。  相似文献   

2.
【目的】疏绵状嗜热丝孢菌是一种嗜热丝状真菌,具有合成与分泌多种耐热酶的能力,从中找寻酶活高、耐热性能优良的β-葡聚糖酶。【方法】对疏绵状嗜热丝孢菌其中一个外切β-葡聚糖酶的编码基因gln B进行克隆,并在毕赤酵母GS115中表达。【结果】在摇瓶水平上重组菌的产酶活为11.5 U/m L,重组酶在SDS-PAGE中的大小约为48 k D。重组Gln B最适作用温度为65°C,最适作用p H为5.0;在低于50°C或p H 3.0-10.0之间具有良好稳定性。重组酶水解海带三糖,首先生成单糖和二糖,延长酶作用时间,可以进一步将其中的二糖部分水解为单糖。【结论】疏绵状嗜热丝孢菌来源的重组酶Gln B为外切β-葡聚糖酶,具有较好的耐热性能和p H稳定性。  相似文献   

3.
【目的】对细菌Solitalea canadensis中编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因进行克隆,通过原核表达获得重组β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并研究其酶学性质。【方法】以Solitalea canadensis基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码β-N-乙酰氨基己糖苷酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖(pNP-β-Glc NAc)为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适p H以及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Solitalea canadensis克隆得到了β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因片段(Gene Bank:WP_014682183.1),全长2586 bp,重组表达所得蛋白表观分子量约为97 k Da,最适pH 6.0,最适温度42°C,但不稳定,半衰期小于5 min。该酶对十二烷基磺酸钠(SDS)敏感,活性受Triton X-100和尿素的抑制。此外二糖分子也能不同程度地抑制该重组酶的活性,特异性抑制剂PugNAc(O-(2-Acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylideneamino)N-phenylcarbamate)对该酶的IC_(50)为2μmol/L。该重组酶蛋白除能水解对硝基苯酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷和对硝基苯酚-β-乙酰氨基半乳糖(pNP-β-GalNAc)外,还能对O-链聚糖核心结构Core Ⅱ末端的乙酰氨基葡萄糖进行水解。【结论】本文首次从Solitalea canadensis中克隆得到能水解末端β1-6连接的乙酰氨基葡萄糖而不能水解β1-4连接键的β-N-乙酰氨基己糖苷酶,并对其进行了酶学性质研究和底物特异性分析,为开发高效特异性强的糖链分析工具酶提供理论基础。  相似文献   

4.
【目的】克隆伯克霍尔德菌ZYB002菌株中的新型脂肪酶lip C24基因,测定其基本酶学性质,为后续深入研究该基因在菌株中的生理功能奠定基础。【方法】根据洋葱伯克霍尔德菌JK321菌株的全基因组DNA信息,直接设计引物从伯克霍尔德菌ZYB002菌株基因组中扩增出lip C24基因,并对之进行原核表达、重组蛋白的纯化及酶学性质分析。【结果】lip C24基因全长1317 bp,编码438个氨基酸残基;多肽链中具有保守五肽-G-X1-S-X2-G-序列;重组蛋白Lip C24的分子量为45 k Da;能有效水解各种对硝基苯酯,对中链脂肪酸的对硝基苯酯表现出偏爱性;其催化水解反应的最适温度为40℃,最适p H7.5;40℃下的半衰期为15.72 min,在p H 7.0-8.0的条件下,具有较好的稳定性。【结论】lip C24的编码产物为一个45 k Da蛋白,具有明显的脂肪酶活性,为中温中性脂肪酶。  相似文献   

5.
【目的】本文通过对具有琼胶降解能力的南极菌Pseudoalteromonas sp.NJ21全基因组进行生物信息学分析,筛选获得琼胶酶疑似序列aga3311,采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行了验证和分析。【方法】首先对aga3311进行克隆和表达;采用Ni-NTA对重组酶进行纯化;DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质;用薄层层析(TLC)和质谱(MS)技术对Aga3311的酶解产物进行分析。【结果】构建的重组表达质粒p ET-30(a)+aga3311能够在工程菌E.coli BL21(DE3)中实现高效表达,其中可溶性表达为30%左右;纯化的重组酶Aga3311分子量为87 k Da,其最适作用温度为35°C,30–45°C的范围内稳定性较高,50°C则迅速失活,具有热不稳定的特征;最适p H为7.0,在p H 4.0–10.0的范围内仍能保持50%以上的活性;金属离子Fe~(3+)、Be~(2+)、Zn~(2+)和Ca~(2+)均能显著提高Aga3311的活性,特别是Ca~(2+)使其酶活提高1倍。该酶的酶解终产物经TLC和质谱分析主要为新琼二糖。【结论】重组酶Aga3311为Glyco_hydro_42家族的外切型β-琼胶酶,能够特异性降解琼脂糖生成新琼二糖。  相似文献   

6.
【目的】克隆表达嗜热古菌Sulfolobus tokodaii strain 7中的ST0929基因,并测定其酶活性。【方法】根据ST0929基因设计引物进行PCR扩增,将这段基因克隆到p ET-15b质粒上,重组质粒导入大肠杆菌BL21细胞中表达。亲和层析纯化酶蛋白,并测定其酶活性。【结果】SDS-PAGE分析表明其分子量大约为83 k D。酶学性质研究表明该酶的最适温度为75°C,最适p H为5.0,具有很强的热稳定性和p H稳定性。该酶还能对多种金属离子和有机溶剂具有一定的耐受性。底物特异性研究发现该酶能够利用麦芽糊精作底物,而不能利用壳寡糖、麦芽糖等。【结论】通过以上酶学性质的研究,说明这种来源于超嗜热古菌的麦芽寡糖基海藻糖合酶在工业生产海藻糖领域具有一定的应用前景。  相似文献   

7.
【目的】克隆芽孢杆菌HJ14的酯酶基因Est Z1并利用大肠杆菌表达得到相应的酯酶,分析重组酯酶的酶学性质和对邻苯二甲酸二乙酯(Diethyl phthalate,DEP)的降解。【方法】特异性扩增酯酶基因Est Z1并对其全长测序,分析其氨基酸序列。利用p EASY-E2表达系统将Est Z1转化到Escherichia coli BL21(DE3)中完成异源表达。根据组氨酸标签纯化Est Z1,研究其酶学性质并利用HPLC和LC/MS检测系统定性分析其对DEP的降解。【结果】Est Z1全长903 bp,编码300个氨基酸残基,蛋白分子量33.84 k Da。Est Z1氨基酸序列分析结果显示,与NCBI数据库收录的HSL-like家族酯酶相似度最高可达到98%。酶学性质分析结果显示,Est Z1可水解碳链长度较短的p-NP底物,最适底物为p-NPC4(p-NP butyrate)。Est Z1的最适p H和最适温度分别为9.0和50°C,并且在p H 7.0–9.5和40–70°C范围内保持50%以上的酶活,为耐热碱性酯酶。Est Z1对多数金属离子和化学试剂保有良好的抗性。Est Z1可将DEP水解生成相应的单酯和醇。【结论】本文报道了Bacillus sp.HJ14来源的酯酶基因并对其在大肠杆菌中表达获得的重组酶的酶学性质进行研究,Est Z1具有良好的碱性p H耐受性和热稳定性,能够部分降解DEP,本研究对邻苯二甲酸酯类的生物降解有一定的参考意义。  相似文献   

8.
【目的】从经过全基因组测序的链霉菌GXT6中克隆、表达一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,研究重组酶的酶学性质并进行相关葡萄糖耐受性的氨基酸残基的分子改造,提高其对葡萄糖的耐受性。【方法】根据链霉菌GXT6的全基因测序结果,对其中一个注释为糖基水解酶的基因设计引物,PCR扩增目的基因,以p SE380为表达载体构建重组质粒,转化至大肠杆菌中诱导表达;采用镍亲和层析技术纯化重组蛋白质,对目的蛋白质进行酶学性质研究;采用定点饱和突变的方法对重组酶进行相关氨基酸残基的分子改造。【结果】从链霉菌GXT6中克隆到一个编码糖基水解酶家族3的新β-葡萄糖苷酶基因,并在大肠杆菌中表达。酶学性质研究结果表明该β-葡萄糖苷酶的最适温度为40°C,最适p H为6.0,Km值为(0.4712±0.0180) mmol/L,Vmax值为(128.000±1.741)μmol/(min·mg),葡萄糖抑制常数Ki值为(1.8880±0.1307)mmol/L。该BGL3-GXT6能够水解黄豆苷、染料木苷、甜茶苷、虎杖苷、淫羊藿苷。还对BGL3-GXT6中与葡萄糖耐受性可能相关的氨基酸残基位点81-Trp和233-Trp进行了定点饱和突变,获得了25个具有酶活的突变酶并对其进行酶学性质研究。其中W233位点饱和突变后获得的突变酶的Km和葡萄糖抑制常数Ki值与重组酶BGL3-GXT6相比均发生明显变化,葡萄糖耐受性有不同程度的提高,最高的提高了209倍。【结论】本研究获得的BGL3-GXT6对天然底物甜茶苷、黄豆苷、染料木苷、虎杖苷和淫羊藿苷具有水解功能,这些特性表明该β-葡萄糖苷酶在理论研究及在工业中有一定的应用价值。  相似文献   

9.
根据海洋来源链霉菌Streptomyces olivaceus FXJ7.023基因组测序结果设计特异引物,通过PCR扩增获得1条全长为1 788 bp的糖苷水解酶15家族蛋白新成员完全编码区DNA片段,该片段编码1个595个氨基酸残基、分子量为66.2 k D的预测蛋白。利用基因工程技术将该片段重组入原核表达质粒p ET32a并转化宿主菌BL21(DE3)ply Ss,IPTG诱导融合蛋白表达,表达的包涵体融合蛋白经纯化、复性后利用DNS法测定其在不同温度、p H条件下催化不同底物产生还原糖的活性。结果表明,该酶能够水解纤维素、淀粉等多种底物产生还原糖活性,且对不同底物表现不同的最适p H和最适反应温度。  相似文献   

10.
【目的】通过构建假交替单胞菌(Pseudoalteromonassp.DL-6)低温几丁质酶(chitinaseA,chi A;chitinase C,chi C)的重组乳酸克鲁维酵母菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质表征,为低温几丁质酶潜在工业化生产几丁寡糖奠定理论基础。【方法】人工合成密码子优化的几丁质酶基因,构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒(p KLAC1-chi A、p KLAC1-chi C)并用电脉冲法转化到乳酸克鲁维酵母中,实现低温几丁质酶的可溶表达。利用镍柱亲和层析纯化得到高纯度的重组几丁质酶。【结果】成功构建产低温几丁质酶的重组乳酸克鲁维酵母并纯化获得高纯度的重组几丁质酶。经SDS-PAGE分析在110 k Da与90 k Da附近出现符合预期大小的蛋白条带。铁氰化钾法测得Chi A和Chi C的酶活分别为51.45 U/mg与108.56 U/mg。最适反应温度分别为20°C和30°C,最适p H分别为8.0和9.0。在低于40°C,p H 8.0–12.0时,Chi A和Chi C重组酶较稳定。Chi A和Chi C对胶体几丁质以及粉状底物α-几丁质与β-几丁质具有明显的降解活性,且具有一定协同降解能力。【结论】首次实现假交替单胞菌来源的低温几丁质酶在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化、酶学性质及其降解产物分析,为其他低温几丁质酶的研究提供借鉴意义。  相似文献   

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