香果树体细胞胚胎发生过程中4种同工酶的研究

用非变性聚丙烯凝胶电泳技术对香果树体细胞胚胎发生及形态建成过程中过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、淀粉酶(AMY)和超氧化物歧化酶(SOD)4种同工酶进行分析.结果表明:香果树体细胞胚胎发生及形态建成过程中,POD、EST、AMY和SOD活性变化与胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的发生发育密切相关.非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织酶谱差异明显,胚性愈伤组织中EST和AMY同工酶酶带多且活性高,非胚性愈伤组织中缺乏EST和AMY同工酶表达,AMY同工酶可作为胚性细胞分化和发育的重要标志.香果树体细胞胚形态建成过程中,球形胚时期的AMY、POD、EST同_T酶活性最强,表明这一时期生理代谢旺盛,是体细胞胚形态建成的关键时期;POD、AMY和SOD 3种同工酶的酶谱及表达强弱在形态建成的不同时期呈现有规律的变化,可作为香果树体细胞胚发生发育特定时期的参考标记. 与胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的发生发育密切相关.非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织酶谱差异明显,胚性愈伤组织中EST和AMY同工酶酶带多且活性高,非胚性愈伤组织中缺乏EST和AMY同工酶表达,AMY同工酶町作为胚性细胞分化和发育的重要标志.香果树体细胞胚形态建成过程 ,球形胚时期的AMY、POD、EST同_T酶活性最强,表明这一时期生理代谢旺盛,是体细胞胚形态建成的关键时期;POD、AMY和SOD 3种同工酶的酶谱及表达强弱在形态建成的不同时期呈现有规律的变化,可作为香果树体细胞胚发生发育特定时期的参考标记. 与胚性愈伤组织的诱导及体细胞胚的发生发育密切相关.非胚性愈伤组织和胚性愈伤组织     

结缕草再生体系的研究

以结缕草品种‘Zenith’(Zoysia japonica‘Zenith’)的种子为外植体,在附加1.0 mg.L-12,4-D和0.1mg.L-16-BA或2.0 mg.L-12,4-D的MS培养基上培养,愈伤组织诱导率较高,分别达到100%和92%。在添加了2.0 mg.L-12,4-D或1.0 mg.L-12,4-D和0.1 mg.L-16-BA的MS培养基上继代培养可诱导出胚性愈伤组织,诱导率分别为3.26%和14.52%。胚性愈伤组织在含0.01mg.L-12,4-D的1/2 MS分化培养基上的分化率和生根率都达到100%。     

文冠果的体细胞胚胎发生

文冠果种子在MS 6-BA 1.0 mg·L-1 2,4-D 1.0 mg·L-1 NAA 1.0 mg·L-1 3%蔗糖的固体培养基上暗培养,形成愈伤组织,愈伤组织在B5 6-BA0.5mg·L-1 NAA0.5mg·L-1 2%蔗糖的培养基中弱光悬浮培养形成体细胞胚.在蔗糖为1%时,子叶状胚萌发形成完整小植株.细胞学观察表明,文冠果体细胞胚源于胚性愈伤组织的外层细胞,此区域细胞富含淀粉粒.     

欧美杂种山杨愈伤组织再生系统的建立

为解决欧美杂种山杨成年树种快速繁殖的问题,并为研究原生质体分离、遗传转化和体细胞变异打下基础,我们建立了愈伤组织再生系统.其愈伤组织诱导最适培养基为WPM 6-BA 1.0 mg·L-1 NAA 0.1 mg.L-1、WPM 6-BA 1.0 mg·L-1,分化培养基为wPM 6-BA 03～1.0 mg.L-1,愈伤组织诱导率和分化率分别为90.67%和92%.     

石刁柏体细胞胚胎发生过程中蛋白质及同工酶变化的研究

本文报道石刁柏胚性愈伤组织的可溶性蛋白质含量与组分、过氧化物酶和酯酶的活力及同工酶带均比其体细胞胚的要少。而在体细胞胚胎发生过程中,过氧化物酶和酯酶活力、可溶性蛋白质含量均以球形胚为最低,子叶分化期胚为最高而呈递增趋势;可溶性蛋白质组分以子叶分化期胚、成熟胚为最多,球形胚、香蕉形胚为最少;过氧化物酶同工酶带以梨形胚为最多,子叶分化期胚、成熟胚为最少;酯酶同工酶则以子叶分化期胚为最多,成熟胚为最少。胚性愈伤组织与体细胞胚均有其特异性可溶性蛋白质及同工酶带,可作为体细胞胚胎发生的分子标记。     

杂交狼尾草胚性愈伤组织的诱导与植株再生

以杂交狼尾草初级愈伤为材料,运用方差分析的方法研究不同因素对杂交狼尾草胚性愈伤诱导率与植株再生率的影响。结果发现,2,4-D和TDZ对杂交狼尾草胚性愈伤诱导影响显著,最佳的胚性愈伤诱导培养基为MS+3.0 mg·L-12,4-D+0.4 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1 TDZ,诱导率为54%;愈伤分化培养基以附加0.1 mg·L-1 TDZ+0.2 mg·L-16-BA+3.2 mg·L-1 CuSO4的 MS培养基为最佳,再生率为68.33%,褐化率为8.33%;分化培养基中添加0.8~3.2mg·L-1的CuSO4均能促进杂交狼尾草愈伤组织分化,而添加AgNO3对杂交狼尾草愈伤分化无显著影响。该技术为离体诱变获得杂交狼尾草低温种质材料奠定了基础。     

大蕉(Musa paradisiaca ABB Linn.)花序愈伤组织的诱导及其体细胞胚发生

大蕉未成熟雄花接种到胚性愈伤组织诱导培养基中,4～5个月后可诱导出胚性愈伤组织,并可在继代培养基上增殖.胚性愈伤组织转移到体细胞胚诱导培养基中可诱导出体细胞胚.体细胞胚在成熟培养基上培养2个月后转移到含有0.2mg·L-1 6-BA的分化培养基上可以萌发,进而形成再生植株.组织学切片证明所诱导的愈伤组织是胚性组织,其所产生的体胚具有典型的单子叶植物体细胞胚的组织结构.     

白刺花胚性愈伤组织诱导及体细胞胚发生和萌发

探讨不同因素对白刺花下胚轴、子叶2种外植体胚性愈伤组织诱导及体细胞胚发生和萌发的影响。以B5和MS为基本培养基,研究2,4-D、6-BA和TDZ对白刺花下胚轴和子叶胚性愈伤组织的诱导;在MS培养基上添加不同浓度2,4-D,研究胚性愈伤组织增殖情况;采用ABA,探究对体细胞胚发生的影响。结果表明:下胚轴比子叶更易诱导胚性愈伤组织,筛选出2种外植最佳的胚性愈伤组织诱导培养基均为MS+2.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L TDZ+0.5 mg/L 6-BA,胚性愈伤组织诱导率分别为77.3%和41.0%。15.0 mg/L ABA、0.2 mg/L 2,4-D和2.0 mg/L 6-BA有利于体细胞胚发生,1/3MS+0.2 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA+2.0 g/L活性炭+25 g/L蔗糖+7 g/L琼脂的培养基可使体细胞胚萌发率达80%以上,再生植株移栽成活率高达90%。白刺花外植体种类及培养基类型均会影响胚性愈伤组织的诱导,其中下胚轴诱导效果优于子叶;MS培养基较适合启动细胞脱分化形成愈伤组织,2,4-D对胚性愈伤组织的增殖保持有调控作用,ABA有利于体细胞胚的发生。     

马尾松幼胚体细胞胚胎发生研究

本论文首次报道了马尾松（Pinus massoniana Lamb.）幼胚体细胞胚胎发生的完整发育过程,并对影响马尾松胚性愈伤组织诱导的因素如球果采种期、球果冷藏处理时间、外植体处理方式等进行了探讨,统计胚性愈伤组织诱导率,进行增殖评价,探讨ABA浓度梯度对马尾松体细胞胚分化成熟的影响,试验数据用SPSS16统计分析软件进行方差分析、差异显著性检验。结果表明：1）2008~2009连续2年内15个采种期得到的幼胚,胚性愈伤组织诱导和增殖有显著性差异,最适宜的马尾松球果采种期是6月下旬至7月下旬,诱导率在9.66%~22.59%之间;2）球果冷藏处理时间,对胚性愈伤组织诱导有显著性差异,其中4℃冷藏球果15d有利于幼胚胚性愈伤组织诱导;3）雌配子体包含幼胚的接种处理方式是可取的;4）胚性愈伤组织经稳定增殖培养后,转入分化成熟培养基,得到体细胞胚状体＂爆发式＂分化成熟,数量多,质量好。适宜体胚成熟转化的培养基为：成熟LP培养基添加ABA5.0mg·L-1＋60.0g·L-1蔗糖,并附加L-谷氨酰胺和水解酪蛋白;5）成熟体细胞胚在无激素萌发型LP培养基上正常萌发,并转化为结构完整的小植株。本研究首次建立了马尾松幼胚体细胞胚胎发生技术平台,为马尾松遗传改良种质创新、缩短育种周期奠定了研究基础。     

何首乌体细胞胚的诱导及植株再生研究

以何首乌茎尖、茎段为外植体,经体细胞胚发生途径,进行胚性愈伤组织诱导、体细胞胚的诱导、植株再生的研究.并采用临时压片法对体细胞胚的发育过程进行观察.结果表明愈伤组织诱导最适培养基为Ms＋6-BA 2.0 mg/L＋NAA 0.5 mg/L,体细胞胚诱导最适培养基为MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L.将产生的体细胞胚首先接种于MS基本培养基使其充分发育后转入MS＋6-BA 2.0 mg/L培养基中诱导出芽,出芽率高于直接采用Ms＋6-BA 2.0 mg/L培养基诱导.体细胞胚的发育过程是首先在愈伤组织表面形成许多瘤状突起即胚性细胞团,胚性细胞团继续发育成球形胚、盾形胚,球形胚、盾形胚成熟后发育成植株.     

领春木体细胞胚胎发生及植株再生

以领春木（Eupteleapleiospermum Hook．f.etThoms．）种子幼胚为试验材料,对领春木体细胞胚胎发生进行了研究。结果表明：在附加1．0mg·L-1 2,4．D＋0．5mg·L-1 6-BA＋3％蔗糖＋0．8％琼脂的Ms培养基上可诱导出愈伤组织。愈伤组织在附加0．5mg·L-1 NAA＋0．5mg·L-1 6．BA的培养基上可形成体细胞胚;体胚在附加0．5mg·L-1 6-BA＋0．05mg·L-1 NAA＋0．1％PVP的1／2MS培养基上能大量增殖;将成熟体胚转移到不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上,培养60d,形成正常植株。     

麻栎成熟合子胚外植体体胚发生和植株再生

为探索麻栎快速繁殖技术新途径,以成熟合子胚为外植体诱导体胚发生,进一步培养形成幼苗。结果表明:体胚诱导以MS+1.0mg.L-1 6-BA+1.0mg.L-1 IBA+1.0g.L-1谷氨酰胺+0.5g.L-1脯氨酸为最优,培养30d诱导率达70.0%;体胚成熟以1/2MS+2.0mg.L-1 6-BA+0.5mg.L-1 IBA+2.0mg.L-1 ABA+4.0g.L-1谷氨酰胺+2.0g.L-1脯氨酸为佳,培养60d,体胚完全成熟;体胚萌发最适培养基为1/2MS+0.2mg.L-1 6-BA+10g.L-1山梨醇,且冷处理有利于体胚的萌发,萌发率高达100%,萌发培养80d,形成再生植株。     

百合体细胞胚胎发生和植株再生

以切花百合(Lilium)品种‘黄天霸’(‘Manissa’)花器官为外植体诱导体细胞胚胎发生与植株再生。结果表明,不同花器官、不同激素配比对愈伤组织形成均具有显著影响。花丝为最佳外植体,激素对愈伤组织诱导的影响效应为NAA>6-BA>2,4-D,最适培养基为MS+1.0 mg.L-1NAA+0.2 mg.L-16-BA;激素诱导体细胞胚胎发生的影响效应为2,4-D>KT>6-BA,最佳培养基配方为MS+1.0 mg.L-12,4-D+0.2 mg.L-1KT+1.0 mg.L-16-BA;MS培养基添加IBA可促进体细胞胚萌发成苗,体细胞胚芽成苗的最佳培养基为MS+0.2 mg.L-16-BA+1.0 mg.L-1IBA。     

水杉愈伤组织诱导及植株再生

通过愈伤组织诱导器官发生途径,建立了水杉（Metasequoia glyptostroboides）的植株再生体系,探讨了不同外植体（种胚、幼叶切块、茎段、根段）和植物生长调节剂对不定芽直接再生和愈伤组织诱导器官发生的影响。结果表明：以种胚、无菌苗叶片、茎段和根作为外植体,在MS补加2,4-D、NAA和6-BA不同组合的培养基上都能诱导得到愈伤组织,其中种胚诱导愈伤组织效果最好,诱导率可达100%,茎诱导效果次之,诱导率为97.1%。诱导愈伤组织效果较好的培养基有：MS＋1.0mg·L-12,4-D＋0.5mg·L-16-BA、MS＋0.1mg·L-16-BA＋1.0mg·L-1NAA、MS＋0.5mg·L-16-BA＋1.0mg·L-1NAA、MS＋1.0mg·L-16-BA＋1.0mg·L-1NAA、MS＋0.5mg·L-16-BA＋2.0mg·L-1NAA、MS＋1.0mg·L-16-BA＋2.0mg·L-1NAA和MS＋0.5mg·L-12,4-D＋0.5mg·L-1NAA。以愈伤组织在MS培养基上植株再生效果最好,再生率为62.5%。     

雷竹体细胞胚诱导的初步研究

以雷竹（Phyllostachys violascens）种胚为外植体, 脱分化产生愈伤组织, 愈伤组织诱导产生体细胞胚, 并发育成苗。实验结果表明： 愈伤组织诱导体细胞胚基本培养基为MS无机盐＋20 g·L^-1葡萄糖（glucose）＋10 mg·L^-1腺嘌呤（adenine sulfate）＋ 0.5 g·L^-1麦芽抽提物（malt extract）＋0.1 mg·L^-1 6-BA＋0.01 mg·L^-1氨氯吡啶酸（picloram）＋10 g·L^-1type A agar; 将基本培养基中的氨氯吡啶酸浓度升高至0.1 mg·L^-1即为愈伤组织诱导的最佳培养基, 早期子叶胚是愈伤组织诱导的最佳胚体; 愈伤组织在添加0.001 mg·L^-1TDZ和0.3 mg·L^-1ABA的愈伤组织最佳培养基上光照培养4周后, 去除其中的ABA, 并添加0.1 mg·L^-1NAA继续培养1个月, 体细胞胚数量最多可达87.43%, 该培养基是体细胞胚发生的最佳培养基; 将上述体细胞胚发生培养基中的6-BA浓度升高至1 mg·L^-1, 继代培养2个月后有小苗出现。组织学观察显示, 体细胞胚细胞核大、质浓且多数呈球形原胚状。     

油松体细胞无性系的建立

以油松（Ｐｉｎｕｓｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ）种胚为外植体,通过器官发生途径建立体细胞无性系。以ＭＳ为基本培养基,在芽的诱导和增殖培养基中,附加植物激素,以６ＢＡ＋ＫＴ和ＮＡＡ效果最好,两者的配比为５－１０：１,６ＢＡ和ＫＴ的浓度分别均不超过１ｍｇ／Ｌ。同时根据培养物的发育状态交替使用活性炭,则对芽的增殖有明显的促进作用。选择发育状态较幼嫩的刚抽茎的外植体,诱导生根,在１／２ＭＳ＋ＫＴ０．１＋ＩＢＡ０．１＋ＮＡＡ０．１ｍｇ／Ｌ的培养基中,生根率达３２．％。体细胞胚胎发生途径建立细胞无性系也已取得成功,筛选出可继代培养的胚性胚柄团无性系,在胚轴和子叶上诱导出成熟的体细胞胚并获得完整小植株。     

Establishment of a System with High Synchronous Frequency of Somatic Embryogenesis and Embryo Seedling Formation in Camellia sinensis var. assamica

The system of high synchronous frequency of somatic embryogenesis and somatic embryo seedling formation was established by means of embryonic cell hne 1 ( CL1 ) of Camellia sinensis var. assamica Kitamura. Modified MS was used as the basic medium. Cultures of CL1 was transferred to the aqueous induced medium (0.05 mg/L 2,4-D + 0.50 mg/L 6-BA) from the maintenance medium (0.1 mg/L 2,4-D + 0.5 mg/L 6-BA) for somatic embryos induction under dark condition. 28 days later, they were cultured in the liquid differentiation medium. Various kinds of somatic embryos were obtained after another 28 days. The frequency of somatic embryos was 81.5 %. Various mesh sizes of sieves were applied to collect the somatic embryos in different developmental stages which could develop to mature stage in the aqueous growth medium ( 1/2 MS + 1.0 mg/L GA3 + 0.5 mg/L 6-BA). ABA was effective to promote the formation of highly qualified somatic embryo. The mature somatic embryos sized 20 to 70 mesh had the conversion frequency 75 %. The development of somatic embryogenesis studied under a cell suspension culture system was similar to the zygotic embryogenesis.     

水母雪莲体细胞胚胎发生及其植株再生

水母雪莲（Saussurea medusa Maxim.)茎和叶片的切段接种于MS＋2mg/L NAA 0.5mmg/L 6-BA的培养基上,20d后产生黄褐色的愈伤组织,经过几个月的继代培养,愈伤组织仍保持旺盛的增殖能力,但部分由黄褐色逐渐变为红色,将红色愈伤组织转到MS＋0．1mg/L NAA＋0．2mg/L 6-BA 5mg/L GA3的培养基上,30d后可分化出大量的体细胞胚,体细胞胚成熟后转到1／2MS＋0．2mg/L IAA 0.5%活性炭的培养基上,30d后可长出2－4cm的根,带根的小苗经锻炼后移栽到土壤中,成活率达76％,细胞组织学观察表明,发育成熟的体细胞胚具有胚根,胚轴和胚芽的完整结构,具有独立的维管系统。     

也门铁的组织培养技术研究

以4品种也门铁的茎段为外植体进行组织培养技术研究。结果表明,控制普通也门铁茎段褐化效果最理想的培养基为MS + 0.25 g·L-1 VC + 0.50 g·L-1 Na2S2O3;诱导也门铁不定芽萌动的最佳培养基为MS + 3.0 mg·L-1 6-BA + 0.2 mg·L-1 NAA + 0.1 mg·L-1 KT;诱导也门铁不定芽增殖的最佳培养基,因品种不同而异,普通也门铁和金心也门铁为MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 1.0 mg·L-1 NAA + 0.1 mg·L-1 GA3,扭纹铁和金心扭纹铁为MS + 1.0 mg·L-1 6-BA + 0.5 mg·L-1 NAA + 0.1 mg·L-1 GA3;也门铁壮苗的最佳培养基为MS + 0.05 mg·L-1 6-BA + 0.05 mg·L-1 NAA + l g·L-1AC;也门铁生根最优培养基为1/2MS + 0.5 mg·L-1 IBA。     

菊芋组织培养快繁技术的建立

以菊芋带芽点的薯盘及带节的幼嫩茎段为外植体,MS为基本培养基,附加不同种类和浓度的生长调节物质,研究菊芋组织培养和快速繁殖的技术环节,最终筛选出最优技术参数组合,建立菊芋再生体系。试验结果表明：茎段外植体是理想的快速繁殖材料,正接（形态学下端向下）是最佳的接种方式。芽诱导最佳培养基为MS＋1.0mg·L-16-BA＋0.2mg·L-1IBA,诱导率为95%;继代增殖最适宜培养基为MS＋2.0mg·L-16-BA;壮苗培养最佳培养基为MS＋0.1mg·L-16-BA;生根适宜培养基为MS＋0.2mg·L-1NAA,生根率达100%;移栽成活率达95%,大田种植成活率达95%以上。