香蕉束顶病毒中国漳州分离物DNA 4的克隆及非编码区的启动子活性初探

应用PCR方法克隆了香蕉束顶病毒中国漳州分离物(Banana bunchy top virus Chinese Zhangzhou isolate, BBTV-ZZ) DNA 4.序列分析表明其序列全长为1 039 nt,归属于亚洲组.5′ RACE分析确定其转录起始位点是269 nt处的A.利用PCR方法亚克隆了BBTV-ZZ DNA 4非编码区序列并将其插入到植物表达载体pCAMBIA 1304中的 gfp∶∶gus 基因上游得到重组质粒pTA2.将含pTA2和pCAMBIA 1304的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)注射进烟草(Nicotiana tabacum L. cv. Xanthi NC)叶片,3～5 d后剪下注射部位的叶片进行GUS和GFP的表达分析.pTA2(含BBTV-ZZ DNA 4非编码区)、pCAMBIA 1304(含CaMV 35S启动子)和未注射的烟草叶片的GUS活性分别为1.007 0 pmol MU*μg-1*min-1 , 2.069 0 pmol MU*μg-1*min-1和0.021 4 pmol MU*μg-1*min-1.注射含pTA2和pCAMBIA 1304植物表达载体根癌土壤杆菌以及未注射的烟草叶片的每毫克总蛋白的GFP间接ELISA在490 nm的吸光值分别为89.577、100.440和3.287.     

马铃薯卷叶病毒P0蛋白抑制RNA沉默及其与AGO蛋白的相互作用

马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)P0是由开放阅读框1(ORF1)所编码,利用农杆菌介导的瞬时表达技术渗透注射转绿色荧光蛋白(GFP)基因的16c烟草叶片发现PLRV-P0能够抑制由GFP mRNA引起的基因沉默,结果表明PLRV-P0是马铃薯卷叶病毒编码的一个基因沉默抑制因子。通过序列分析发现PLRV-P0基因序列中含有两个重复的WG基序,我们将PLRV-P0基因序列中第87位和第140位的色氨酸(W)点突变为丙氨酸(A)(命名为P0WA),构建植物表达载体pCAMBIA1300-CE-P0,pCAMBIA1300-CE-P0WA,农杆菌渗透注射本氏(Nicotiana benthamiana)烟草叶片,通过荧光显微镜观察发现PLRV-P0和AGO共同注射后有绿色荧光出现而PLRV-P0WA和AGO共同注射后则没有绿色荧光出现。研究结果初步表明,PLRV-P0能够和AGO蛋白发生相互作用,重复的WG基序是其与AGO蛋白相互作用的关键氨基酸。     

水曲柳节律基因LHY启动子的克隆和功能分析

以水曲柳基因组DNA为模板,用Site Finding-PCR法扩增得到节律基因LHY（late elongated hypocotyl）启动子序列,长度为1 360 bp。PLACE启动子预测工具分析表明,序列中含有转录必备的TATA box、CAAT box以及一些非生物胁迫和激素响应元件等。构建植物GFP瞬时表达载体p PXGFP-P-LHY,农杆菌介导转化烟草叶片和白桦悬浮细胞,GFP检测结果表明,LHY启动子能够启动GFP基因在烟草和白桦细胞中表达,且对非生物胁迫（低温、高温、盐）产生响应;构建植物GUS报告基因整合表达载体p PCXGUS-P-LHY,农杆菌介导法瞬时转化烟草,GUS染色结果表明,LHY启动子的活性具有不同程度的时空特性。     

受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化

中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室袁磊。刘学群。王春台利用已克隆的1个甲基茉莉酸（MeJA）诱导的糖基转移酶（GTs）基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,其长度约为1．4kb。用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP—GUS,通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38后,     

大麦黄矮病毒运动蛋白是RNA沉默抑制因子

大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus,BYDV)属黄症病毒科家族,其基因组包含6个开放阅读框(open reading frames,ORFs).将BYDV的6个基因分别克隆到pWEIMING101载体上,得到重组基因.电击转化农杆菌后,利用农杆菌瞬时表达方法渗透注射转GFP基因的本氏烟草16c植株的叶片,在长波长紫外灯下观察GFP的表达,并通过Northern blot证明所得现象.研究结果表明,BYDV的PAV株系ORF4编码的运动蛋白(movement protein,MP)是RNA沉默抑制因子,其表达可以抑制局部和系统RNA沉默.BYDV-MP与GFP的双链RNA(dsGFP)共表达后仍能抑制RNA沉默,荧光强度与叶片中GFP的mRNA和其沉默降解形成的siRNA的量有对应关系,其N端核定位序列对抑制局部基因沉默起主要作用,第5、6位氨基酸是抑制基因沉默的关键氨基酸.BYDV-MP单独渗透注射的部位均产生细胞死亡.     

木醋杆菌纤维素合成操纵子的克隆及棉花转化

革兰氏阴性菌木醋杆菌 (Acetobacterxylinum (Brown)Yamada)合成一种由纤维素微纤丝组成的胞外带状物。与高等植物纤维素相比 ,它具有独特的结构和机械性能。根据从木醋杆菌ATCC 5 35 82克隆的acs纤维素合成操纵子序列设计引物 ,用PCR的方法从木醋杆菌Ay2 0 1中克隆了ayacs纤维素合成操纵子的全部 4个基因。序列比较发现 ,两者高度同源。将连上CaMV 35S启动子的acsA、acsB克隆到植物表达载体pCAMBIA 130 1上 ,acsC、acsD克隆到pCOB30 2_3中。然后通过花粉管通道法转化棉花 (Gossypiumhirsutum)胚珠 ,收获的种子在含有卡那霉素和除草剂的双抗培养基上进行筛选。PCR检测发现 934粒种子中有 5棵植株含有全部 4个基因。这是首次将编码 4个功能蛋白的细菌操纵子成功地转入棉花     

植物microRNA功能瞬时验证体系的建立

目的:建立植物microRNA(miRNA)功能的瞬时活体验证体系,并检验该体系的有效性。方法:选用双元表达载体pCAMBIA1200,并插入烟草花叶病毒双35S启动子,以驱动目标miRNA超表达;选用双元表达载体pFGC5941的绿色荧光蛋白(GFP)改造载体用于潜在的靶基因与GFP融合蛋白的超表达,以转入这2种载体的农杆菌侵染烟草叶片,观察GFP融合蛋白的荧光,作为验证miRNA对其潜在靶基因调控作用的瞬时验证体系。选取拟南芥已知功能的miR393及其靶基因AFB3,分别构建pCAMBIA1200-35S-miR393和pFGC5941-GFP-AFB3载体,利用农杆菌注射烟草叶片进行2个载体共转化,并以pFGC5941-GFP-AFB3单转化作为对照,激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白的表达。结果:只将AFB3导入烟草表皮细胞,可观察到绿色荧光;而将miR393与AFB3同时导入烟草表皮细胞后,未能观察到绿色荧光。表明miR393抑制了AFB3的表达。结论:本瞬时表达体系可作为植物miRNA功能的活体瞬时验证体系,为miRNA调控靶基因表达功能提供简单、快速、有效的证据。     

毛头鬼伞真菌具有抗烟草花叶病毒活性的y3基因的克隆及对烟草的转化

【目的】蛋白质Y3具有抗烟草花叶病毒(TMV)活性并由y3基因编码。本文的目的是从真菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)中克隆y3基因全长并在植物体中展现其对TMV的抑制活性。【方法】我们利用试剂盒5′-Full RACE Core Set(TaKaRa)扩增了y3基因cDNA5′-端未知序列,通过RT-PCR获得了全长序列,并把该全长序列与CaMV 35 S启动子和NOS终止子一起插入多克隆位点(MCS)构建了植物表达载体pCAMBIA1301-y3,用于农杆菌介导的烟草转化。【结果】y3基因全长534碱基对,包含1个开放阅读框(ORF),编码一条含130个氨基酸残基的肽链(GenBank检索号:GQ859168;EMBL:FN546262)。其cDNA序列和由它推到的氨基酸序列均与已发表的y3基因部分片段有高度相似性(94%)。Northern杂交分析证实了y3基因在转基因烟草中得到表达。接种TMV的转基因植株表现出抗TMV的活性。【结论】我们克隆了y3基因全长并得到了转基因植株。在转基因植株中,由于y3基因的表达改善了植株的抗病毒活性。y3基因的克隆和表达无疑为该基因的进一步研究奠定了基础。     

油葵含油量相关基因在烟草中的表达

采用RT-PCR和RACE技术从油葵(Helianthus annuus L.)种子中克隆了DGAT基因的cDNA全长序列,命名为HaDl(GenBank登录号为HM 015632).将HaDl与CaMV 35S组成型启动子融合,构建植物表达载体pBI-HaDl,通过根癌农杆菌介导转化烟草.对转基因植株进行GUS及PCR检测,同时采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析转基因烟草叶片中脂肪酸各成分的含量.结果表明:HaDl基因cDNA全长1 936 bp,最大开放阅读框为1 524 bp,编码507个氨基酸;推测的氨基酸序列与其它植物已报道的DGAT1基因的氨基酸序列一致性为70%～80%,具有DGAT1蛋白保守的二酰甘油结合基序"HKWIVRHLYFP",因此HaDl基因属于DGAT1基因家族.GUS活性染色及PCR检测均证明外源HaDl整合到烟草基因组并成功表达.转基因烟草叶片脂肪酸含量测定发现,油酸、软脂酸和硬脂酸的含量得到提高,推测HaDl是植物油脂合成相关的重要基因.     

信息交流

受MeJA诱导的烟草GTs基因启动子的克隆及转化中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室袁磊,刘学群,王春台利用已克隆的1个甲基茉莉酸(MeJA)诱导的糖基转移酶(GTs)基因,以PCR扩增得到该基因启动子序列,其长度约为1.4kb,用改造后的双元载体pCAMBIA1301与GTs基因启动子连接,构建了含目的启动子与GUS基因的融合基因质粒pCAP-GUS,通过根癌农杆菌介导的烟草叶盘转化法转化烟草W38后,经PCR检测验证得到了含有融合基因的转基因烟草植株。此研究为进一步深入研究GTs基因的功能奠定了基础。     

Investigation of the mechanism of temperature sensitivity of the electroreceptors of ampullae of lorenzini

In experiments on Black Sea skates (Raja clavata), the potential of the receptor epithelium of the ampullae of Lorenzini and spike activity of single nerve fibers connected to them were investigated during electrical and temperature stimulation. Usually the potential within the canal was between 0 and –2 mV, and the input resistance of the ampulla 250–400 k. Heating of the region of the receptor epithelium was accompanied by a negative wave of potential, an increase in input resistance, and inhibition of spike activity. With worsening of the animal's condition the transepithelial potential became positive (up to +10 mV) but the input resistance of the ampulla during stimulation with a positive current was nonlinear in some cases: a regenerative spike of positive polarity appeared in the channel. During heating, the spike response was sometimes reversed in sign. It is suggested that fluctuations of the transepithelial potential and spike responses to temperature stimulation reflect changes in the potential difference on the basal membrane of the receptor cells, which is described by a relationship of the Nernst's or Goldman's equation type.I. P. Pavlov Institute of Physiology, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. I. M. Sechenov, Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry, Academy of Sciences of the USSR, Leningrad. Pacific Institute of Oceanology, Far Eastern Scientific Center, Academy of Sciences of the USSR, Vladivostok. Translated from Neirofiziologiya, Vol. 12, No. 1, pp. 67–74, January–February, 1980.     

Determination of stoichiometry of radioiodination of proteins

A sensitive method for the detection of small quantities of hydrophobic antioxidant free radical scavengers such as butylatedhydroxytoluene (BHT) and butylatedhydroxyanisole (BHA) in aqueous samples is described. The procedure involves extraction of the hydrophobic free radical scavenger into an organic solvent phase, followed by the subsequent reaction of an aliquot of this extract with the stable cation radical tris(p-bromophenyl)amminium hexachloroantimonate (TBACA). In experiments with BHT and BHA, the loss of TBACA absorbance at 730 nm was found to be linearly proportional to the amount of antioxidant added, with quantities of BHT as small as 200 pmol being easily detectable. In aqueous suspensions of dimyristoylphosphatidylcholine vesicles, assays of the aqueous BHT concentration showed that BHT partitioned strongly into the membrane phase, achieving very high BHT/phospholipid ratios. For a given concentration of BHT, partitioning into the membrane phase was greater in large, multilamellar liposomes than in either small, single-walled vesicles or in purified rat brain synaptic vesicle membranes. Direct assay of BHT and BHA in phospholipid membranes, however, was complicated by a nonspecific interaction between TBACA and the phospholipid.