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相似文献
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1.
[目的]通过比较cry1A、cry3A、cry4A和cry8E四个基因的启动子转录活性,筛选出一个强启动子,利用强启动子构建一个苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)高效表达载体.[方法]利用启动子融合lacZ技术检测了4种启动子的转录活性.通过扫描电子显微镜观察晶体、SDS-PAGE、蛋白定量和生物活性测定等方法对新建高效表达载体进行功能验证.[结果]构建了Pcry1A、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E4个启动子融合报告基因lacZ的表达载体,经β-半乳糖苷酶活性分析得知,启动子活性从高到低依次为Pcry8E>Pcry1A>Pcry4A>Pcry3A.选取cry8E启动子,以pHT315作为基础载体构建苏云金芽胞杆菌高效表达载体pHT315-8E21b,将cry1Ac基因连接到pHT315-8E21b和广泛应用的cry3A启动子指导的pSXY-422b上,分别转入无晶体突变株HD-73-,获得菌株HD-8E1Ac和HD-422-1Ac.扫描电子显微镜观察显示,HD-8E1Ac菌株可以形成菱形晶体,说明正确表达了cry1Ac基因.SDS-PAGE分析结合蛋白定量实验表明pHT315-8E21b表达效率高于pSXY-422b.对小菜蛾(Plutella xylostella)的生物活性测定表明HD-8E1Ac菌株对小菜蛾有生物活性,且菌株活性高于HD-422-1Ac.[结论]利用强启动子Pcry8E构建了一个能在Bt中高效表达的穿梭载体pHT315-8E21b,该载体可正确表达cry1Ac基因,其表达效率高于被广泛应用的pSXY422b.  相似文献   

2.
摘要: 【目的】构建苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt) sigK 基因插入失活突变体,分析突变体特点并明确其对cry3A 基因启动子的影响。【方法】采用同源重组技术在苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因中插入卡那霉素抗性基因,构建了sigK 基因插入失活突变体。通过生长曲线测定、扫描电子显微镜观察晶体、芽胞形成情况和芽胞计数及SDS-PAGE 等方法分析了突变体的特点; 构建了遗传恢复菌株对上述性状进行了功能验证; 利用启动子融合lacZ 技术检测了cry3A 基因启动子的转录活性。【结果】获得了苏云金芽胞杆菌HD-73 菌株sigK 基因突变体,生长曲线测定表明,突变体较出发菌株在稳定期后期生长较慢; 扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变体丧失了形成芽胞和晶体的能力; SDS-PAGE 分析表明突变体中伴胞晶体蛋白的表达量明显低于出发菌株和恢复菌株。利用载体pHT315 携带sigK 基因及其启动子在突变株中表达,所获得的遗传恢复菌株恢复了突变株产生芽胞和晶体的能力; sigK 基因的突变可以提高cry3A 基因启动子在产胞后期的转录活性,对cry3A 启动子指导的Cry 蛋白表达量没有显著影响。【结论】本研究证明sigK 基因为苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,并影响伴胞晶体蛋白的产量; sigK 基因功能的丧失有利于cry3A 基因启动子在产胞后期的转录。  相似文献   

3.
【目的】利用非cry基因启动子PexsY(芽胞外壁基质组成蛋白编码基因启动子)表达Cry1Ac晶体蛋白,发现可用于cry基因表达的新元件,为高效工程菌的构建奠定基础。【方法】采用启动子融合lacZ技术,通过β-半乳糖苷酶活性分析了PexsY启动子和截短的PexsY启动子的转录活性;利用该启动子在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)HD73菌株中表达了cry1Ac基因,通过透射电子显微镜观察晶体形态;蛋白定量、SDS-PAGE比较蛋白产量;生物活性测定进行功能验证。【结果】PexsY启动子在芽胞晚期转录活性很高,透射电镜观察到利用该启动子表达的cry1Ac基因形成了菱形晶体,SDS-PAGE分析可以检测到133kDa的Cry1Ac蛋白,且与cry3A启动子指导表达的蛋白产量相近,少于cry8E启动子指导表达的蛋白产量;生物活性测定表明PexsY指导表达Cry1Ac蛋白对玉米螟(Ostrinia furnacalis)具有杀虫活性。【结论】在Bt无晶体突变体中,非cry基因启动子PexsY可以正常表达133kDa的Cry1Ac蛋白,并形成晶体,具有在芽胞形成晚期表达cry基因的能力,该类启动子将在Bt工程菌构建中发挥重要作用。  相似文献   

4.
【目的】在大肠杆菌中表达纯化苏云金芽胞杆菌HD73的转录调控因子Sigma K(σK)。【方法】PCR扩增出苏云金芽胞杆菌HD73中sig K基因的ORF(Open reading frame)装载到带有His标签的表达载体p ET21b上,转入到表达菌株BL21(DE3)中获得重组菌株BL21(p ETsig K),通过SDS-PAGE、镍柱亲和纯化、阴离子交换纯化和凝胶迁移实验(EMSA)等方法对Sigma K蛋白进行提取、纯化和生物活性分析。【结果】正确表达出大小约为27 k D的His-Sigma K蛋白,并获得了纯化的蛋白。EMSA结果表明纯化的His-Sigma K蛋白可以与受其控制的cry1Ac基因启动子结合。【结论】表达和纯化了His-Sigma K蛋白,His-Sigma K具有与受其控制的启动子结合的功能。  相似文献   

5.
【目的】构建带有苏云金芽孢杆菌cry3a基因非芽孢依赖启动子和绿色荧光蛋白基因gfp(Green Fluorescent Protein)的原核表达载体,并转化从桑粒肩天牛幼虫肠道分离的两株常驻细菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,以检测cry3a启动子在昆虫肠道常驻菌中的启动子活性,获得GFP标记菌株,为常驻菌在昆虫幼虫肠道中的定殖情况和杀虫工程菌的构建奠定基础。【方法】采用重叠延伸PCR将cry3a基因启动子和gfp基因进行融合,并与pHT304载体连接构建重组质粒pHT3AG,获得的重组质粒以电脉冲转化肠道常驻菌短短芽孢杆菌CQUBb和苏云金芽孢杆菌CQUBt,于可见光和荧光显微镜下观察荧光并通过SDS-PAGE分析重组菌株的蛋白表达情况,然后对重组菌株进行生长动力学分析和稳定性测试。【结果】重组菌在营养期大量组成型表达GFP,经电泳分离在凝胶上出现约29kDa的特异蛋白条带;重组菌生长曲线与出发菌没有显著差异,说明外源质粒未对宿主菌的生长带来明显不利影响;抗性条件下传代30次后两菌株外源质粒稳定性仍可达95%、67%;两个菌株比较,CQUBb比CQUBt质粒转化率高、重组菌GFP表达时间长、表达量大,并且重组菌株稳定性好。【结论】成功地将cry3a基因核心启动子和gfp基因转入桑粒肩天牛幼虫肠道常驻菌,实现了该启动子在Bt之外的菌株中发挥作用,构建了两个GFP标记菌株;重组基因工程菌株表达量大,稳定性好,可以用作昆虫肠道内微生态研究和芽孢杆菌表达系统以及杀虫菌株的构建。  相似文献   

6.
王壵  邓超  彭琦  陈榛  张杰  黄大昉  宋福平 《微生物学报》2010,50(11):1550-1555
摘要:【目的】研究群体信号应答蛋白编码基因nprR在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)HD-73菌株晶体蛋白形成过程中的作用。【方法】通过同源重组,构建了HD-73 nprR基因缺失突变菌株HD73(ΔnprR )。利用启动子-lacZ融合、SDS-PAGE方法,测定不同培养基中nprR基因转录活性及nprR基因缺失对cry1Ac转录及表达的影响。【结果】启动子转录活性分析表明,在LB和SSM培养基中nprR基因从对数期结束(T0)开始表达,稳定期持续表达。在LB培养基中,nprR基因的缺失使cry1Ac基因在生长过渡期和稳定期前期转录活性显著提高,同时HD73(ΔnprR )菌株Cry蛋白生成量也明显高于出发菌株HD-73,但是在芽胞形成释放后,Cry蛋白的表达没有明显的区别。【结论】在丰富培养基中苏云金芽胞杆菌nprR基因的缺失在生长过渡期和稳定期前期能够提高cry1Ac基因转录和表达,从而缩短了cry基因表达时间,并且Cry蛋白总产量与出发菌株相当。  相似文献   

7.
【目的】分析spoIIID基因突变对苏云金芽胞杆菌cry1、cry3、cry4和cry8基因启动子Pcry1Ac、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E的影响,比较以上启动子在无芽胞spoIIID基因突变体(HD-△SpoIIID)中的转录活性。【方法】分别构建了Pcry1Ac、Pcry3A、Pcry4A和Pcry8E与lacZ基因融合的转录分析载体,并导入HD-73野生型菌株和HD-△SpoIIID突变株中测定β-半乳糖苷酶活性;通过高温诱变方法在HD-△SpoIIID基础上筛选出缺失cry1Ac基因的HD--△SpoIIID突变体;构建了4种启动子与cry1Ac基因融合表达载体,分别将它们转入HD-ΔSpoIIID和HD--ΔSpoIIID中,分析Cry1Ac蛋白表达量及其生物活性。【结果】HD-73和HD-ΔSpoIIID菌株中四个启动子转录活性由高到低分别为:Pcry8E>Pcry1Ac>Pcry4A>Pcry3A;spoIIID基因的缺失未影响Pcry1Ac和Pcry8E转录活性,Pcry3A在HD-ΔSpoIIID菌株中转录活性略有升高,Pcry4A在HD-ΔSpoIIID菌株中转录活性在T5到T10略有降低。从翻译水平来看在HD-ΔSpoIIID中cry8E启动子略低于cry1Ac启动子,并高于Pcry4Aa,Pcry3A指导的Cry1Ac蛋白产量,生物活性测定结果与蛋白表达量相符。【结论】cry8E基因启动子Pcry8E在spoIIID突变体中在转录水平活性是最高的启动子,而cry1Ac启动子指导自身基因cry1Ac表达时,在翻译水平上略高于cry8E启动子指导的Cry1Ac产量。  相似文献   

8.
摘要:【目的】构建苏云金芽胞杆菌spoIIID基因缺失突变株,并研究其与出发菌株的表型及性质差异。【方法】采用基因同源重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株中的spoIIID基因,构建了spoIIID缺失突变株,测定生长曲线,并通过扫描电子显微镜观察,芽胞计数分析及SDS-PAGE 蛋白电泳比较突变株与出发菌株的差异。构建遗传互补菌株,观察菌株性状的回复情况。【结果】通过温敏载体同源重组敲除技术获得了苏云金芽胞杆菌HD-73菌株spoIIID基因缺失突变株,生长曲线测定表明,突变株较出发菌株在平稳期后期生长较缓和;扫描电子显微镜观察和芽胞计数分析显示,突变株基本丧失了形成芽胞的能力,但依然形成晶体。SDS-PAGE结果显示,在 SSM培养基中,突变株对伴胞晶体蛋白的形成量影响并不显著;在营养较富集的Luria-Bertani培养基中,突变株中伴胞晶体蛋白的形成量较野生型和互补株明显降低。利用载体pHT315携带spoIIID操纵子互补突变株,互补株恢复了产生晶体和芽胞的能力。【结论】本研究证明spoIIID基因是苏云金芽胞杆菌芽胞形成所必需,同时与晶体蛋白的表达相关。  相似文献   

9.
对利用苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)强启动子——cry1Ac基因启动子p1Ac指导cry基因在大肠杆菌中的表达进行了研究。结果显示,大肠杆菌中由启动子p1Ac指导表达的Cry1Ac蛋白与苏云金芽胞杆菌来源的Cry1Ac蛋白在碱溶性、胰蛋白酶活化、杀虫活性等方面有较好的一致性,从而解决了目前商业化载体大肠杆菌表达cry基因时形成不易溶解的包涵体问题。同时,还对p1Ac指导的cry1Ac基因在大肠杆菌中表达的发酵条件进行了初步探索。  相似文献   

10.
【目的】在苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)中表达截短后的转宿主粘虫颗粒体病毒(Pseudaletia unipuncta granulovirus-Ps, PuGV-Ps)增效蛋白,为构建增效Bt工程菌提供理论基础。【方法】通过对截短后增效蛋白的密码子进行优化,构建增效蛋白及其融合蛋白表达载体,分析不同启动子指导下增效蛋白表达量的变化,明确增效蛋白对Bt的增效活性。【结果】本研究构建了表达载体pHTPcry1AcCoEn81、 pHTRHCoEn81和pHTNCCoEn81, SDS-PAGE结果显示pHTPcry1AcCoEn81和pHTNCCoEn81分别可以产生81 kDa和134 kDa的重组蛋白。启动子Pcry1Ac和Pcry8E指导下的增效蛋白表达量和重组增效蛋白产量均无显著性差异。生物测定结果表明,重组增效蛋白可以显著增加Bt对小菜蛾的杀虫活性。【结论】研究结果表明,密码子优化的PuGV-Ps增效蛋白可以在Bt中表达并具有显著增效活性,为高效苏云金芽胞杆菌工程菌的构建及...  相似文献   

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Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.  相似文献   

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Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.  相似文献   

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Curcumin is the yellow pigment of turmeric that interacts irreversibly forming an adduct with thioredoxin reductase (TrxR), an enzyme responsible for redox control of cell and defence against oxidative stress. Docking at both the active sites of TrxR was performed to compare the potency of three naturally occurring curcuminoids, namely curcumin, demethoxy curcumin and bis-demethoxy curcumin. Results show that active sites of TrxR occur at the junction of E and F chains. Volume and area of both cavities is predicted. It has been concluded by distance mapping of the most active conformations that Se atom of catalytic residue SeCYS498, is at a distance of 3.56 from C13 of demethoxy curcumin at the E chain active site, whereas C13 carbon atom forms adduct with Se atom of SeCys 498. We report that at least one methoxy group in curcuminoids is necessary for interation with catalytic residues of thioredoxin. Pharmacophore of both active sites of the TrxR receptor for curcumin and demethoxy curcumin molecules has been drawn and proposed for design and synthesis of most probable potent antiproliferative synthetic drugs.  相似文献   

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正Dear Editor,In December 2019, a novel human coronavirus caused an epidemic of severe pneumonia(Coronavirus Disease 2019,COVID-19) in Wuhan, Hubei, China(Wu et al. 2020; Zhu et al. 2020). So far, this virus has spread to all areas of China and even to other countries. The epidemic has caused 67,102 confirmed infections with 1526 fatal cases  相似文献   

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