拟南芥F-box基因At3g16740的表达分析

拟南芥At3g16740基因为F-box基因家族成员,其功能尚不清楚.通过连续和瞬时光照处理分析,发现蓝光、红光和远红光都诱导At3g16740基因的表达,其中远红光的诱导作用最明显.蓝光受体cry1、cry2,红光受体phyB或远红光受体phyA突变导致At3g16740基因表达的光诱导作用减弱或者消失,表明该基因为光信号通路相关基因.通过实时荧光定量PCR分析At3g16740基因在拟南芥不同组织器官中的表达,发现其在拟南芥根、茎、叶、花和果荚中都有表达,花和果荚中的表达量最高,推测该基因可能参与植物花和/或果荚的发育.酵母双杂交分析发现,At3g16740蛋白通过F-box结构域与拟南芥ASK(arabidopsis-SKP1-like)家族成员ASK1、ASK2和ASK11相互作用,表明At3g16740是SCF(Skp、Cullin、F-box)复合物的成员.     

拟南芥醛还原酶编码基因At3g04000表达模式分析及过量表达转基因植株获得

植物体内的α,β-不饱和活性醛类化合物对植物细胞具有毒害作用,清除这些α,β-不饱和活性醛类化合物对于植物细胞维持正常的生命活动至关重要。前人研究报道通过体外酶活测定和异源瞬时表达鉴定拟南芥 At3g04000基因编码的蛋白为 NADPH 依赖的叶绿体醛还原酶(Arabidopsis NADPH-dependent chloroplastic aldehyde reductases, AtChlADRs),推测其在清除叶绿体中长链(≥5)α,β-不饱和醛类物质中具有重要的功能。该研究主要构建了拟南芥 At3g04000基因的表达模式分析载体 ProAt3g04000：GUS、亚细胞定位分析载体At3g04000-EGFP 和过量表达载体 At3g04000-OE,并获得了转基因拟南芥,并通过实时定量 PCR 分析了At3g04000基因在拟南芥不同组织中的转录水平。结果表明：拟南芥 At3g04000基因在幼苗中的转录水平最高,在莲座叶、茎生叶、花序和角果中均有较高的转录水平;而在根部和茎秆中的转录水平较低。通过对ProAt3g04000：GUS 转基因植株的 GUS 染色分析可知,At3g04000基因在子叶、莲座叶和萼片的维管组织和保卫细胞中均有较强的表达,在根的维管组织中有较弱的表达。通过共聚焦显微镜对 At3g04000-EGFP 转基因植株的观察和分析发现,At3g04000不是定位于叶绿体中,而是定位在细胞质和细胞核中。该研究结果为深入研究拟南芥醛还原酶编码基因 At3g04000的功能奠定了基础。     

拟南芥磷酸酶基因亚细胞定位与组织表达

通过克隆拟南芥磷酸酶PP2C家族基因At3g51370,构建了绿色荧光蛋白融合表达载体,用基因枪将构建好的载体轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析,发现该At3g51370基因表达蛋白定位在细胞核中;用实时定量PCR方法分析At3g51370基因的组织表达特性,发现该基因在花器官中的表达量明显高于其它组织.进一步构建了含At3g51370基因的启动子和GUS报告基因的植物表达载体,经农杆菌介导转化拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色,分析该启动子在不同生长时期与不同组织中的转录活性,结果发现,在幼苗期At3g51370基因主要集中在根尖分生组织和顶端分生组织表达,在成年植株中则集中在生殖器官如花和果荚柄等部位表达,在光照和黑暗条件下,At3g51370基因的表达特性没有明显差异.研究表明,At3g51370可能与其它核定位的PP2C磷酸酶一样参与了基因表达的调控,可能在拟南芥早期发育阶段的细胞增值分裂相关信号转导途径中发挥功能,并在花器官的发育过程中行使功能,且不参与光信号转导.     

人工microRNAs对拟南芥At1g13770和At2g23470基因的特异沉默

DUF647(Domain of unknown function 647)蛋白家族是在真核生物中广泛存在的、高度保守的蛋白家族。拟南芥中该基因家族共有6个成员,迄今为止拟南芥DUF647家族中4个成员的功能尚不清楚。文章以拟南芥内源MIR319a前体为骨架,构建了敲减DUF647家族中2个基因At1g13770和At2g23470表达的人工microRNAs(Artifical microRNAs,amiRNAs)。利用WMD(Web microRNA designer)平台设计分别靶向At1g13770和At2g23470基因的amiRNAs序列,通过重叠PCR置换拟南芥MIR319a前体序列。构建融合amiRNAs前体的植物表达载体pCHF3-amiRNAs,在农杆菌介导下转化拟南芥。RT-PCR分析表明,amiRNAs能够显著抑制At1g13770和At2g23470基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因株系。At2g23470-amiRNA转基因植株At2g23470转录水平的下调导致育性严重下降。文章为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

拟南芥中ELO家族同源基因的克隆与表达

采用RT-PCR方法,克隆了拟南芥中可能参与超长链脂肪酸合成的ELO家族同源基因At1g75000、At4g36830和At3g06470的全长cDNA,构建其与eGFP基因融合的植物表达载体At1g75000::eGFP::NOS/pPZP211、At4g36830::eGFP::NOS/pPZP211和At1g06470::eGFP::NOS/pPZP211,并利用基因枪介导法将构建的植物表达载体转入洋葱表皮细胞,并在荧光显微镜下检测到了绿色荧光信号.为进一步研究拟南芥中AtELO家族同源基因的功能奠定基础.     

拟南芥F-box基因At5g22700的功能初步分析

F-box蛋白作为SCF（Skpl,Cullin and anF-boxprotein）复合体的成员,参与调节植物的生长发育过程。At5g22700为功能未知的F-box基因家族成员。本研究通过酵母双杂交分析At5g22700蛋白与ASK（Arabidop-sis-SKP1-1ike）家族蛋白的相互作用,发现At5g22700蛋白的F-box结构域与ASK4蛋白相互作用。实时定量PCR分析该基因在不同组织器官中的表达,发现该基因在根和花中的表达量最高,说明At5g2700可能在根和花的发育中具有重要作用。以At5g22700基因的T—DNA插入突变体和过量表达转基因株系为材料,分析不同光照条件下幼苗的表型,发现蓝光下At5g22700过量表达转基因幼苗的主根比野生型长。这些研究结果表明,At5g22700在植物体内可能形成SCF复合体,并在植物幼苗主根伸长生长中起促进作用。     

拟南芥CYCD2;1基因植物表达载体的构建及在烟草中的遗传转化分析

细胞分裂是生物的基本特征之一,在植物生长发育的过程中,发挥着极其重要的作用,细胞周期蛋白CYCD2;1基因作为一个调控因子,对调节细胞周期具有重要作用。本文以拟南芥细胞周期蛋白(At CYCD2;1基因)作为研究对象,利用PCR技术从拟南芥花序c DNA扩增出At CYCD2;1基因,构建植物表达载体(pROKIIAt CYCD2;1)并利用农杆菌介导的叶盘法转化野生型烟草。转基因植株的PCR检测结果表明,At CYCD2;1基因已经整合到了烟草基因组中。在T2代植株中,通过实时定量荧光PCR检测显示,At CYCD2;1在mRNA水平也均有表达。过量表达CYCD2;1的转基因烟草在花器官中存在明显表型,与野生型相比主要表现为转基因植株花冠宽度变大,花瓣和萼片长度变长,果实变大,上述结果表明At CYCD2;1基因影响花的发育。     

AtPIN2基因通过影响根尖抗氧化能力参与拟南芥耐铝响应

PIN2是根尖生长素运输的重要蛋白,PIN2基因的差异表达是否影响植物耐铝性并不清楚。本文以不同At PIN2表达水平的拟南芥为材料,研究了At PIN2差异表达对拟南芥耐铝性的影响。结果表明,铝处理明显增强拟南芥根尖0~5 mm区域At PIN2基因的转录表达,与对照相比,其表达量增加了80%。铝能诱导PIN2蛋白在根尖细胞膜水平方向累积,并且呈束状分布。通过分析不同At PIN2表达材料的耐铝性,发现在铝处理条件下,PIN2缺失突变体(pin2-ko)的根系伸长速率显著小于PIN2超表达(PIN2-OX)和野生型材料(Col);并且,pin2-ko累积较多的活性氧;pin2-ko的SOD、CAT和APX活性以及GSH含量均显著低于PIN2-OX。上述结果表明,At PIN2表达差异影响拟南芥耐铝性,敲除At PIN2导致其对铝毒更敏感,其机理可能是At PIN2通过影响根尖抗氧化能力参与拟南芥耐铝响应。     

拟南芥At5g01510和At5g49820基因人工microRNAs的构建与鉴定

以拟南芥内源MIR319a前体为骨架,构建沉默DUF647家族基因At5t01510和At5g49820表达的人工microRNAs,研究其对目的基因表达的抑制效果。利用WMD平台设计分别靶向At5g01510和At5g49820的amiRNAs序列,通过重叠PCR改造拟南芥MIR319a骨架序列,使其包含我们设计的特异amiRNAs序列。构建35S：：amiR-At5g0150和35S：：amiR-At5g49820融合基因,以农杆菌介导的花苞浸染法转化获得转基因拟南芥。RT-PCR分析表明,人工microRNAs能够显著抑制靶基因的表达,获得了抑制效果明显的转基因植株。本工作为进一步研究这两个基因的功能奠定了良好的基础。     

拟南芥3个蛋白磷酸酶2C基因编码蛋白的亚细胞定位及组织表达分析

利用gateway技术从拟南芥中克隆了3个蛋白磷酸酶2C基因At5G66080、At1G68410和At5G06750,3个基因的ORF全长分别为1 158 bp、1 311 bp和1 182 bp,分别编码一条385、376和393个氨基酸残基的多肽.构建了3个基因的植物表达载体35S:GFP:At5G66080、35S:GFP:At1G68410和35S:GFP:At5G06750,采用基因枪法进行的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明,荧光信号主要分布在细胞核上,显示这3个基因的产物可能在细胞核上发挥作用.利用实时荧光定量PCR研究At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在不同组织中的表达特性,结果表明:3个基因在各个器官均有表达,但表达量不同;At5G66080、At1G68410和At5G06750基因在花中表达量最大;At5G66080和At5G06750基因在根、叶和叶柄中的表达量次之,在茎中的表达量最低;At1G68410基因在根中的表达量次之,在茎、叶和叶柄中的表达量较低.