我国大麦条纹花叶病毒的研究——Ⅱ.核酸组分的分离和鉴定

新疆小麦上分离到的大麦条纹花叶病毒(BSMV-XJ),经2.4%聚丙烯酰胺和0.5%琼脂糖凝胶电泳检出四个组分,与Argentina Mild和North Dakota 161毒株的RNA组分数相同。分离的BSMV-XJ的单个RNA组分没有侵染性,四个RNA组分的混合物有侵染性,说明侵染性需要一个以上的RNA组分。培养病毒的温度似对各组分的含量有影响。BSMV-XJ RNA经单分子展层后,在电镜下观察伸展的没有折迭卷曲的线状分子,其中有些分子长度约1,200～1,300毫微米,正好相当于其RNA链的长度。     

我国大麦条纹花叶病毒的研究 Ⅱ.核酸组分的分离和鉴定

新疆小麦上分离到的大麦条纹花叶病毒(BSMV-XJ),经2.4%聚丙烯酰胺和0.5%琼脂糖凝胶电泳检出四个组分,与Argentina Mild 和North Dakota 161毒株的RNA 组分数相同。分离的BSMV-XJ 的单个RNA 组分没有侵染性,四个RNA 组分的混合物有侵染性,说明侵染性需要一个以上的RNA 组分。培养病毒的温度似对各组分的含量有影响。BSMV-XJRNA 经单分子展层后,在电镜下观察伸展的没有折迭卷曲的线状分子,其中有些分子长度约1,200～1,300毫微米,正好相当于其RNA 链的长度。     

用于直接固定全细胞中mRNA的快速吸印技术

溶于NaI的信使RNA(mRNA)将吸附在硝酸纤维素膜上。在低温下,核糖RNA、天然DNA和变性DNA的结合是很少的。固定的mRNA使用于分子杂交,并可被翻译成蛋白质,或反转录成DNA。     

应用于DNA分子转移和分子杂交实验的二偶氮苄氧甲基(DBM)-滤纸性质的研究

DBM-滤纸与硝基纤维素一样,近年来广泛地用作DNA或RNA分子的载体来进行分子杂交实验。但是在进行小分子DNA的分子和杂交实验中,以及需要用几种不同的分子探针在同一个DNA载体上反复地进行分子杂交时,DBM-滤纸显示了更大的优越性。用小球菌核酸酶水解鸡红血球细胞核,抽提出DNA并用[~(32)P-γ]ATP和T_4多核苷酸激酶制备成5’末端标记的DNA分子。经2%琼脂糖电泳,DNA分子按染色质的核小体结构的一系列不同长度(从单体至五聚体)的片段被分开。胶经过NaOH和NaOAC处理,将DNA分子转移到DBM-滤纸上。此滤纸再经NaOH和H_2O处理,分别测定从单体至五聚体的不同分子量DNA的转移效率。结果指出,电泳胶经过转移前处理,单体和二聚体的损失分别为7%和5%,三聚体至五聚体没有损失。转移后仍留在电泳胶上的DNA为2—3%。经过转移后处理的DBM-滤纸所结合的DNA分子,从单体到五聚体分别为89%,91%,96%,94%和94%。因此,在所分析的分子量范围内,DNA分子基本上定量地被转移。用~(32)P标记的SV40 DNA作为探针,检测DNA碱变性与分子杂交效率的关系。结果指出,分子杂交之前,DBM-滤纸经NaOH的处理是必须的,但DNA被转移到DBM-滤纸之前,对电泳胶的碱处理步骤是可以省略的。     

用反义RNA和催化RNA抑制艾滋病毒

艾滋病毒(HIV)是一种逆病毒(retrovirus),其生、死均靠其RNA。因之,有些抑制艾滋病毒的方法都以其RNA为进攻目标。其中,一种是使用互补RNA分子封阻病毒RNA的活性,一种是使用具有催化活性的RNA分子消解病毒的某些RNA片段;前一种称作‘反义法’,后一种叫做‘RNA类酶(Ribozyme)法’。     

绒毛烟斑驳病毒卫星RNA的一种突变体的初步研究

用电泳检测VTMoV88感染绒毛烟后病毒特异性核酸组份,发现核酸的小分子RNA(卫星RNA)组成发生变化。提纯的病毒通过电镜观察及血清学鉴定并与VTMoV加以比较,证明两者在颗粒形态、大小及血清学关系上一致。以克隆的VTMoV—RNA3 cDNA片断为探针检测VTMonV与VTMoV88卫星RNA分子之间的核苷酸序列同源性,结果显示出两种毒源的卫星RNA具有高度同源性。据此,推测VTMoV88可能是卫星RNA发生变异的突变体,并对VTMoV 83卫星RNA突变体形成机制进行了初步探讨。     

植物中 RNA 分子系统运输的研究进展

RNA 分子主要以单链的形式存在于生物体内,既担负着贮存及转移遗传信息的作用,又能作为核酶直接在细胞内发挥代谢功能 . 在植物中 RNA 也可作为活跃的信号分子调控基因表达和发育 . 介绍了包括病毒 RNA 、 RNA 沉默信号、特异内源 RNA 等 RNA 分子,在植物体内的系统运输及其在植物基因表达调控中所起作用的研究进展 .     

新疆大麦条纹花叶病毒的研究——Ⅰ.病毒株系类型的鉴定及核酸的体外翻译

我国大麦条纹花叶病毒(BSMV)新疆分离物的RNA,在50％甲酰胺6％甲醛中,50℃处理15分钟,使RNA分子链呈真正的均一状态后,在含甲醛的琼脂糖凝胶上电泳,核酸变性电泳结果显示该病毒为三组分RNA株系,编号为RNA_1,RNA_2,RNA_3,分子量分别为1.40—1.44×10~(?),1.20—1.28×10~0,1.06—1.09×10~6。经制备凝胶电泳分离出的各RNA组分在兔网织红细胞溶胞液的无细胞体系中,RNA_1的翻译产物为120K的蛋白,RNA_2翻译产物主要为25K和一个85K蛋白,其中25K蛋白由于与天然BSMV外壳蛋白共电泳,该蛋白中没有甲硫氨酸,以及能被BSMV抗血清沉淀,而被确定为BSMV外壳蛋白。RNA_3的翻译产物为75K蛋白。     

一种高效经济的高质量植物RNA提取方法

建立了一种高效经济的植物RNA提取方法.在提取缓冲液中加入蔗糖、氯化钾和镁离子以提供对RNA分子的保护.破碎后的细胞于提取缓冲液中裂解后,用酚/氯仿变性并去除内源RNA酶和其他蛋白质,而后用pH 5.6 的NaAc沉淀RNA.用该方法提取RNA的得率较高,经电泳检测,RNA的完整性很好.RNA印迹分析和RT-PCR也都得到很好的结果.该方法还使实验成本大大降低.     

蛋白质的印迹法

所谓印迹法就是生物样品(如核酸、蛋白质等)先经过凝胶(琼脂、聚丙烯酰胺等)电泳后,载有样品区带或点子的凝胶通过压片扩散或电泳迁移,把凝胶中分离的样品转移到硝酸纤维素滤纸上,并用一定的探针进行检测的方法。     

检测烟草中烟草花叶病毒的RNA斑点杂交法

用普通烟草花叶病毒OM株3′-端约2kb的cDNA为探针,探索了用RNA斑点杂交法对烟草组织中烟草花叶病毒RNA进行检测的条件。这些条件包括用分子杂交法观察云南烟区和上海烟草上分到的烟草花叶病毒与OM株的同源性,从烟草组织中提取烟草花叶病毒的几种方法的比较,使RNA有效地固定在硝酸纤维素滤膜上的方法,烟草组织中是否有干扰RNA固定和杂交的物质,斑点杂交方法检测烟草花叶病毒的特异性、灵敏度等。     

甜菜坏死黄脉病毒RNA4 cDNA克隆、序列分析及其编码蛋白基因在大肠杆菌中的表达

以甜菜坏死黄脉病毒(Beet Necrotic Yellow Vein Virus,简称BNYVV)内蒙分离物(NM)RNA为模板,通过反转录和PCR扩增得到了BNYVV RNA4基因组的cDNA克隆pGBF6。序列分析结果表明,pGBF6含有全长RNA4 cDNA插入片段,大小为1465个核苷酸,含有一个849个核苷酸的开放阅读框架,编码产生由282个氨基酸组成的分子量为31kDa的蛋白。与法国F2分离物RNA4相比,其核苷酸序列和由此推导的氨基酸序列同源性分别为97.1％和96.4％,并在5'端非编码区比F2分离物缺失了3个核苷酸。将RNA4编码区cDNA克隆到原核表达载体pFLAG·MAC上,获得融合蛋白表达质粒pFMBF87。所构建的融合蛋白由载体序列编码的14个氨基酸和31kDa蛋白C端的233个氨基酸组成。经IPTG诱导,Westem blotting分析表明,该融合蛋白在大肠杆菌中得到高效表达。本文还对内蒙分离物的株系划分进行了讨论。     

水稻齿叶矮缩病毒基因片段的分离及体外翻译

通过1％琼脂糖电泳和十六烷基溴代三甲胺介导RNA相转移分离法,将水稳齿叶矮缩病毒基因组分为5个组份,基因组双链RNA经羟甲基汞变性后,在兔网状红细胞溶胞物翻译体系中,能高效地表达病毒蛋白质。每个RNA片段至少能编码一种蛋白蛋,但各个片段的翻译活性有明显差异。分析了该病毒基因组各组份与其表达产物的对应关系。     

大麦条纹花叶病毒新疆株血清学及基因同源性检测

在我国新疆从小麦上分离到的大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic Virus,BSMV),可以侵染大麦、小麦、玉米等重要粮食作物。主要以带毒种子传播病毒。大麦、小麦种子带毒率达70％以上。BSMV曾一度使世界主要的大麦产区减产25～30％,是影响农业生产的重要病毒。从预防病害流行和探索该种子传RNA病毒作为植物基因工程载体的可     

特异切割马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的核酶研究

根据锤头状核酶的作用模式,设计、合成并克隆了特异性切割马铃薯地病毒中国分离株（ＰＬＲＶ－Ｃｈ）复制酶基因负链ＲＮＡ的核酶序列,以体外转录的ＰＬＲＶ－Ｃｈ复制酶基因负链ＲＮＡ作为底物,与转录的核酶ＲＮＡ共同保温,以检测核酶对底和的体外切割作用。实验结果表明,核酸疼 ＲＮＡ对ＰＬＲＶ－Ｃｈ复制酶基因负锭ＲＮＡ具有特异切割作用。     

A variant of the satellite RNA of groundnut rosette virus that induces brilliant yellow blotch mosaic symptoms in Nicotiana benthamiana

Some Malawian cultures of groundnut rosette virus (GRV) give rise to variants that, although still causing symptoms of the chlorotic type of rosette in groundnut, induce brilliant yellow blotch mosaic symptoms, instead of the usual veinal chlorosis and mild mottle, in Nicotiana benthamiana. One such isolate (YB) induced the formation in infected plants of a 0.9 kbp dsRNA having extensive sequence homology with molecules of similar size in other naturally occurring isolates of GRV. These dsRNA molecules were shown to be double-stranded forms of single-stranded satellite RNA molecules. Experiments in which the satellite was removed from and restored to isolate YB, or exchanged with those from other GRV isolates, showed that it carries the determinant for yellow blotch mosaic symptoms. Plants inoculated with the 0.9 kbp dsRNA (denatured or undenatured) developed yellow blotch mosaic even when the satellite-free GRV helper was not inoculated until 11 days later. The satellite RNA is therefore a very stable molecule. Prior infection of N. benthamiana with a GRV isolate containing a normal form of the satellite protected against expression of yellow blotch mosaic symptoms when the plants were later inoculated with isolate YB, whereas prior infection with satellite-free isolates did not. This provides a simple method of determining whether a GRV isolate has an associated satellite RNA. The YB satellite seems to be a newly recognised variant additional to those known to cause the chlorotic, green and other forms of groundnut rosette disease.     

Isolation of bacteriophage λ containing yeast ribosomal RNA genes: Screening by in situ RNA hybridization to plaques

We have developed an in situ hybridization technique which can be used to screen large numbers of hybrid bacteriophage for the presence of a particular inserted DNA sequence. Plaques of hybrid phage are formed on E. coli lawns on nitrocellulose filters, and their DNA is released, denatured, and fixed directly on the filters for hybridization to radioactive RNA probes. We have used this technique to isolate a number of hybrid bacteriophage λ which contain EcoRI restriction fragments of the ribosomal RNA genes from yeast, and have examined the DNA from several of these phage.     

不同阶段乙型流行性感冒病毒核酸的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

本文应用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),比较了7株不同阶段乙型流感病毒代表株的核酸电泳迁移率,发现不同阶段毒株的PAGE基因图是不同的。这种差别与乙型流感病毒血清学的结果基本相符。     

不同CMV分离物侵染寄主的超微结构变化

应用电镜观察了黄瓜花叶病毒ＣＭＶ不同分离物侵染寄主的细胞超微结构变化。来自一患红（Ｓａｌｖｉａｓｐｌｅｎｄｅｎｓ）的不含卫星ＲＮＡ分离物Ｍ－２２侵染心叶烟,病毒粒子散布于细胞质,在液泡中形成大片病毒粒子结果,液泡膜边缘产生小泡结构,完整的病毒粒子穿过胞间连丝在细胞间运转,胞间连丝中央部分有扩张现象。