番木瓜环斑病毒YsCP基因的序列分析和植物表达载体的构建

用双脱氧链终止法分析了克隆的番木瓜环斑病毒（PRV）Ys株系外壳蛋白（CP）基因的序列,结果表明YsCP基因全长858nt。对PRV国内外16个株系或分离物CP基因的比较发现,YsCP基因与国内株系或分离物CP基因的同源性较高（94．44％～97．68％）,而与国外株系或分离物CP基因的同源性较低（88．88％～92．70％）。CP基因之间的差异主要靠近基因5’端,特别是在YSCP基因第63nt后连续缺失6nt,SmGTHAI和SRI的CP基因也在此处缺失3nt。将YsCP基因插入中间质粒pRokⅡ的CaMV35S启动于和nos终止序列之间形成CP基因的植物表达载体pRPCY,通过三亲交配使pRPCY进入农杆菌LBA4404,与其中的pAL4404构成双元载体系统。     

番木瓜环斑病毒在番木瓜原生质体中复制的初步研究

以1.0％的Macerozyme R—10,1.5％的Cellulose Onozuka R—10,0.45mol/L的甘露醇和pH5.4的培养基作为分离番木瓜原生质体的最佳条件,得到了高活力和高产量的原生质体。PRV-Ys(Vb)株系和聚鸟氨酸(PLO,WW200000)分别以1μg/ml的最终浓度接种番木瓜原生质体(5×10~6原生质体/ml),成功地建立了PRV—番木瓜原生质体体系。对于PRV在番木瓜原生质体中复制的行为动态差异,本实验研究了PRV-Ys和PRV-Vb两株系,三个不同抗性梯度的番木瓜原生质以及不同培养温度之间相互作用,相互影响的关系,从而认为PRV不仅能在寄主品种Carica papaya var,F1和C.papaya var.Tw-5而且还能在非寄主C.stipulata的原生质体中进行增殖;环境温度不仅能影响PRV在番木瓜细胞中的增殖能力,而且还能影响植株细胞本身的生活能力和抗PRV侵染的能力;PRV-Ys和PRV-Vb两株系在C.papaya var.F1原生质体中的增殖潜伏期和增殖曲线没有明显差异。     

番木瓜环斑病毒检测技术的研究

本研究在37℃条件下,以硝酸纤维素滤膜(NCM)为载体:3％酪蛋白为封闭剂、辣根过氧化物酶标记的A蛋白为酶标结合物(SPA-HRP)和以稀释100倍兔抗PRV-Ys的IgG为其工作浓度,成功地建立了检测PRV的间接Dot-ELISA。其检测灵敏度达到了较满意的ng水平。同时,本研究以PRV-Ys株系RNA作模板、oligo(dT)~(12-18)作引物、pUC19作cDNA克隆载体和以E.coli JM107作受体,采用缺口翻译(Nick Translation)方法成功地制备了pYs6 cDNA分子探针(插入片段约300bp)。其检测PRV-RNA的灵敏度达到了较理想的pg水平。     

菲对转基因番木瓜进行大田种植试验

AgBiotech Reporter2005年22卷3期17页报道：已知环斑病毒是多年来美国夏威夷州番木瓜种植业减产的严重病害。近据菲律宾的非赢利机构菲律宾生物技术联合会（BCP）主席BienvenidoPecson博士宣称,为防止环斑病毒对番木瓜的危害,菲律宾正在培育可有效地抵抗环斑病毒的新的转基因番木瓜品种,并批准对其进行大田种植试验。此外,菲律宾农业、林业和天然资源研究和开发委员会（PCARRD）的科学家已对上述品种的基因进了鉴定。     

番木瓜环斑病毒畸叶株系的CP基因克隆和序列分析

采用RT－PCR方法合成了本研究室保存的番木瓜畸叶病毒（PMaLV）的外壳蛋白（CP）基因,将其CP基因克隆进Promega公司的pGEM-T and pGEM-T Easy Vector System（简称T－载体）,并进行了序列分析。结果表明,PMaLV CP基因核苷酸序列全长为861nt,推导其编码287个氨基酸。与番木瓜环斑病毒（PRSV）美国夏威HA株系和澳大利亚W株系的CP基因相比,在第66nt处开始连续缺失3个核苷酸。与PRSV的华南Ys、Sm和G株系以及夏威夷的HA和澳大利亚的W株系相比,其CP基因序列同源率分别为96％、98％、95％、89％和89％。其的氨基酸序列同源率分别为98％、97％、97％、96％和95％。此结果表明,PMaLV属于PRSV的一个株系,不是一种新病毒。因此,我们称其为番木瓜环斑病毒畸叶株系（ML株系）。     

番木瓜环斑病毒（PRV）提纯的研究

番木瓜环斑病毒（ＰＲＶ）提纯的研究高文通（黄埔动植物检疫局，广州５１０７００）高乔婉，范怀忠（华南农业大学植保系，广州５１０６４２）关键词番木瓜环斑病毒，病毒提纯四十年代末，美国首次报道的番木瓜环斑病（ＰａｐｅｙａＲｉｎｇｓｐｏｔＶｉｒｕｓ，ＰＲＶ）...     

Cloning and Sequencing of Coat Protein Gene of Papaya Ringspot Virus and Sequence Comparison of Strains of PRV-P and PRV-YS

Papaya rinspot virus (PRV) was isolated and purified from infected papaya (Carica papaya L. )leaves in Hainan Island. The first strand of cDNA was synthesized with Olig(dT)as a primer. The coat protein gene of PRV was obtained by PCR techniques with primers synthesized accoding to the DNA sequence of PRV-P. Full length of cDNA clone encoding coat protein of PRV was sequenced and analysed. The result shows that the strain of PRV we isolated contains 881 nucleotides with 287 amino acids. Sequences among several strains of PRV were compared and it indicates an over 90% homology in DNA sequence of PRV-G the strain we isolated with PRV-P and PRV-YS. Highly convered sequence was located in carboxyl end and interestingly highly variable region was in N-terminal.     

dsRNA介导的番木瓜环斑病毒（PRSV）的抗病性研究

以模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）和烟草（Nicotiana tabacum）及PRSV寄主植物番木瓜（CaricapapayaL.）作为试验材料,开展了番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因dsRNA介导的PRSV病原抗性的研究。利用农杆菌介导法将番木瓜环斑病毒外壳蛋白CP基因反向重复表达载体pHellsgate12-CPIR（简称PHG12-CPIR）分别转化到烟草和拟南芥中,获得阳性植株,并利用渗透法和农杆菌介导的瞬时表达体系将pHG12-CPIR载体导入到番木瓜中。对转基因植株进行攻毒试验并分析了其抗病性。在接种3~7d内,在拟南芥和番木瓜上转基因植株的发病情况较轻,而野生型植株叶片与转基因植株相比,均表现出不同程度的黄化、皱缩和枯斑等症状。在接种PRSV后,番木瓜和拟南芥转化植株表现症状的叶片的比例与对照相比,结果显著低于对照,而在烟草植株上症状表现的差异不明显。在3种植物上RT-PCR检测结果显示,在接种番木瓜环斑病毒PRSV后,野生型植株中有高浓度的病毒积累,而转pHG12-CPIR基因植株中几乎没有病毒积累,推测转pHG12-CPIR基因植株中瞬时表达系统已启动RNAi机制抑制了CP基因的表达。     

番木瓜抗病突变体阻碍环斑病毒体内运转

应用RT－PCR一步法检测了PRSV Ys株系在感病番木瓜及其抗病突变体植株体内的运转动态,结果表明：在感病植株中,接种后48hr接种叶的未接种部位可检出病毒,第4天部分接种叶柄可检出病毒,第6天植株各部位均能检出病毒;而在抗病植株中,接种后可以而且仅能在接种部位检出病毒;因而认为抗病突变体能够阻碍病毒从接种部位运出及（或）向未接种部位运入。     

番木瓜环斑病毒单克隆抗体的制备及在病毒分型上的初步应用

本试验是用番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus, PRV)提纯制剂免疫的BALB/c小白鼠脾细胞与Sp~2/o-Ag14骨髓瘤细胞融合,获得三个能稳定传代并分泌抗番木瓜环斑病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞系。其中23H1 McAb的效价较高,用ELISA检测,腹水抗体效价高达1:76800,能被PRV兔抗血清所阻断。这3个杂交瘤细胞系产生的单抗与TMV和CMV无血清交叉反应。它们可把PRV四个毒株初步区分为三个血清型。     

Variation in the Coat Protein Gene of Papaya ringspot Virus Isolates from Multiple Locations of China

The potyvirus Papaya ringspot virus （PRSV） is an important pathogen of papaya that causes severe losses in economic crops for papaya production globally. The coat protein （CP） genes of five PRSV isolates originating from different locations in China were cloned and sequenced. The CP-coding region varied in size from 864-873 nucleotides, encoding proteins of 288-291 amino acids. The five Chinese isolates of PRSV have been characterized as papaya-infecting （PRSV-P）. The CP sequences of the Chinese isolates were compared with those of previously published PRSV isolates originating from different countries at amino acid levels. A number of KE repeat boxes in the N terminus of the PRSV-CP were found in all Chinese isolates. The phylogenetic branching pattern revealed that there was certain extended grouping between geographic locations, and the Asian type probably represents the oldest population of PRSV. The information of CP genes will be useful in designing and developing durable virus resistant-PRSV transgenic papaya in China. Meanwhile broad-spectrum-virus resistant, strongly resistant-PRSV and good safe papaya lines are required.