首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到19条相似文献,搜索用时 187 毫秒
1.
目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。  相似文献   

2.
目的:构建含Ubc9的逆转录病毒表达载体,筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系,深入研究SUMO化修饰的作用。方法:聚合酶链反应(PCR)扩增获取目的基因Ubc9,定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVneo,形成重组质粒pMSCV-Ubc9;脂质体法将pMSCV-Ubc9转染逆转录病毒包装细胞PT67;G418筛选产毒细胞克隆,扩大培养产毒细胞克隆,收获病毒感染NIH3T3细胞。结果:限制性酶切和测序鉴定证实Ubc9正确插入逆转录病毒表达载体。G418筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆,收获病毒能有效感染NIH3T3细胞。结论:携带Ubc9基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCV-Ubc9构建成功,转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒,进而筛选获得了能转录表达Ubc9的产毒细胞系PT67-Ubc9。  相似文献   

3.
目的:构建携带有Netrin-1基因的逆转录病毒载体,为研究Netrin-1在神经发育中的作用奠定基础。方法:PCR扩增Netrin-1基因片段后,将其克隆入慢病毒表达载体pLXSN;通过PCR、酶切、测序鉴定重组质粒。重组质粒转染PA317包装细胞后获得包装的病毒颗粒。病毒颗粒感染人脑胶质瘤细胞SW038-C2,经Western blot证明重组病毒在真核细胞内表达Netrin-1的情况。结果:经PCR扩增、酶切和测序验证,重组质粒构建正确,命名为pLX-NT。Western blot证明在感染细胞泳道有一特异性条带。结论:成功构建了能表达Netrin-1的慢病毒载体。  相似文献   

4.
目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。  相似文献   

5.
目的:构建携带Grb2-SH2基因重组慢病毒载体。方法:把Grb2-SH2基因从合成的工程载体PUC-57中导到入门载体pentr-3C中,再利用LR反应重组到目的载体plenti,通过酶切和测序分析对比验证Grb2-SH2基因后,将plenti-Grb2-SH2质粒利用慢病毒转染系统转染人胚胎肾上皮细胞株293T细胞获得携带Grb2-SH2慢病毒载体。结果:构建的重组质粒经酶切及测序和分析比对鉴定正确,目的基因片段大小约为500bp;该质粒与包装质粒共转染293T细胞获取的慢病毒,转染效率约为90%。结论:成功构建转载质粒plenti-Grb2-SH2及携带Grb2-SH2基因慢病毒载体。  相似文献   

6.
目的:构建K-RasGl2D基因突变体慢病毒载体。方法:从病人组织中提取RNA通过RT—PCR反转录获得cDNA作为K-RasGl2D基因模板,通过PCR法扩增出K-RasGl2D基因突变体片段。将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV—MCS—EF1-RFP中,构建K-RasG12D基因突变体逆转录病毒真核表达载体。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5a,挑取转化平板上的细菌克隆,在抗生素培养液中培养过夜后进行PCR鉴定。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果:所构建的K-RasGl2D突变体基因逆转录病毒真核表达载体经PCR鉴定和测序鉴定正确,转染293T细胞后可以观察到可检测到高强度表达的RFP荧光信号。结论:成功构建了重组真核表达载体,为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究K-Ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。  相似文献   

7.
薛玲  李航  张静  王净  吴雅岚  姬秋和  叶菁 《生物磁学》2011,(6):1083-1086
目的:利用AdEasy腺病毒表达系统构建含有小鼠脂肪储存小滴蛋白5(LSDP5)基因的重组腺病毒。方法:从小鼠肝脏cDNA克隆出LSDP5基因全长,克隆至pMD18-T载体中,酶切测序。回收酶切产物,连接到腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV,构建pShuttle-CMV-LSDP5重组质粒,经PmeI酶切线性化后转化至含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183中。筛选阳性克隆,提取重组质粒,PacI酶切线性化并转染AD293细胞进行包装,提取病毒DNA,鉴定重组病毒并检测病毒滴度。结果:LSDP5基因克隆经测序证实与Genebank公布一致,双酶切重组pMD18-T载体得到1400 bp左右的片段。重组穿梭载体经Kpn I和Sal I双酶切后得到预期片段。PacI酶切得到30 Kb大片段和4.5 Kb小片段。转染AD293细胞后收集病毒,经PCR鉴定,获得理想的目的片段。取病毒上清反复感染AD293细胞以扩增病毒,最后所得病毒滴度为2.5×109pfu/ml。结论:成功构建了携带脂肪储存小滴蛋白5基因的重组腺病毒载体,为进一步研究LSDP5基因功能奠定基础。  相似文献   

8.
目的:构建K-RasG12D基因突变体慢病毒载体。方法:从病人组织中提取RNA通过RT-PCR反转录获得cDNA作为K-RasG12D基因模板,通过PCR法扩增出K-RasG12D基因突变体片段。将酶切的片段克隆入真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-RFP中,构建K-RasG12D基因突变体逆转录病毒真核表达载体。将连接产物转化至感受态大肠埃希菌DH5α,挑取转化平板上的细菌克隆,在抗生素培养液中培养过夜后进行PCR鉴定。经测序正确后转染293T细胞系,利用重组质粒PCR及串联基因表达的检测等方法对目的基因的转录与表达进行分析与鉴定。结果:所构建的K-RasG12D突变体基因逆转录病毒真核表达载体经PCR鉴定和测序鉴定正确,转染293T细胞后可以观察到可检测到高强度表达的RFP荧光信号。结论:成功构建了重组真核表达载体,为下一步建立稳定转染细胞系及进一步研究K-Ras突变在癌症发病中的作用奠定了基础。  相似文献   

9.
为了构建包含牛c-myc基因编码序列的重组载体,以胎牛原始生殖嵴为材料,用RT-PCR方法克隆出牛c-myc 基因的编码序列,将其亚克隆至pMD19-T载体,再从酶切鉴定和测序正确的质粒上切下目的片段,定向克隆到pIRES2-AcGFP1-Nuc表达载体上,挑选序列正确的重组真核表达质粒转染牛皮肤成纤维细胞,用RT-PCR和Western blotting分别检测c-myc mRNA和蛋白的表达。结果表明,从胎牛原始生殖嵴中正确克隆了c-myc基因的全长编码序列,所构建的重组质粒能够在皮肤成纤维细胞中有效  相似文献   

10.
旨在构建小鼠角质细胞生长因子(KGF)真核表达载体pCDsR-UKA,通过脂质体转染法转染小鼠胚胎干细胞( mESC),并进一步优化其转染条件,最终获得可以正常生长并稳定表达红色荧光蛋白的转KGF基因的ES细胞.利用RTPCR技术扩增小鼠KGF基因cDNA并构建表达载体pCDsR-UKA (6.6 kb),经鉴定正确的重组质粒DNA用脂质体包裹后转染mESC.从小鼠成纤维细胞cDNA扩增出891 bp的KGF基因片段与UHS启动子和BGH polyA序列成功重组到pCDsRed2载体中.经酶切和DNA测序验证,插入载体的DNA片段为KGF基因且方向正确.采用脂质体法优化转染条件,mESC最高转染效率达到(34.4±4.1)%.经G418筛选的转基因ES细胞通过PCR鉴定证实外源基因已整合在ES细胞基因组中.成功获得了小鼠KGF基因片段,以及真核表达载体pCDsR-UKA,经优化的脂质体悬浮法转染条件,在六孔板中当DNA与脂质体比例为3:10时,可获得最佳转染效率且不改变ES细胞的生长状态,经筛选获得了转基因ES细胞克隆.为下一步通过四倍体补偿技术获得ES小鼠提供了转基因ES细胞.  相似文献   

11.
为构建表达人神经元素3基因(neurogenin 3,ngn3)的重组逆转录病毒载体,建立稳定表达ngn3的包装细胞株,本研究以流产人胎儿胰腺组织为材料,通过RT-PCR方法克隆出人ngn3基因,将其连接到pMD18-T载体上并测序,结果表明,测序得到的基因序列与发表的人ngn3基因序列(GenBank Accession No.BC126468)完全一致。将EcoRI和HpaI双酶切后的基因片段构建到pMSCV-neo逆转录病毒载体中,酶切鉴定结果表明,pMSCV-ngn3重组逆转录病毒载体构建成功。脂质体法将pMSCV-ngn3重组载体导入PT67包装细胞,G418筛选后,对得到的细胞株进行RT-PCR和免疫组化检测,结果显示,该细胞株在mRNA水平和蛋白水平均稳定表达Ngn3;收集该细胞株的培养上清液,进行RT-PCR检测及电镜观察,结果表明,该细胞株将导入的重组逆转录病毒载体pMSCV-ngn3包装成了具有感染性的病毒颗粒,并将其释放到了培养上清液中。以上结果表明PT67-ngn3包装细胞株建立成功。该细胞株的成功建立,为下一步将ngn3基因应用于提高人胎儿胰腺祖细胞诱导分化效率方面的研究奠定了基础。  相似文献   

12.
应用PCR从兔多杀性巴氏杆菌C51-3株基因组DNA中扩增出编码36 kD黏附蛋白的cp36基因, 将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。以重组质粒pMD18-cp36为模板, 用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟黏附蛋白基因cpm36, 并克隆到原核表达质粒pQE30中, 得到重组质粒pQE30-cpm36, 转化大肠杆菌M15, 在IPTG诱导下表达融合蛋白CPM36, 经Ni2+-NTA亲和层析纯化。DNA测序结果表明cp36基因片段大小为1032 bp, 与已报道的16个血清型多杀性巴氏杆菌cp36基因的核苷酸序列比较, 同源性在76.9%~100%之间。SDS-PAGE结果显示, 表达分子量约为37 kD的带有6×His标签的CPM36蛋白, 与预期分子量相符。Western blotting结果表明, 抗重组蛋白抗体分别能与CPM36蛋白和多杀性巴氏杆菌36 kD蛋白发生特异性反应, 证明原核表达蛋白具有抗原性, 为进一步开展多杀性巴氏杆菌免疫保护性抗原的研究奠定了基础。  相似文献   

13.
应用RT PCR方法扩增了编码猪瘟病毒石门株 (CSFVshimenstrain)囊膜糖蛋白E2全基因 ,然后将其克隆到pMD 1 8T质粒中 ,获得重组质粒pMD E2。再以pMD E2为模板 ,另行设计两对引物 ,同时扩增其中一段适于在E .coli中表达且抗原反应性较好的基因片段 (E2蛋白A D抗原区基因序列 ) ,将扩增的两片段串联插入原核表达载体pET 32a中构建成重组质粒pET 2e。用酶切和序列分析鉴定插入目的基因的正确性。SDS PAGE和Western blot分析表明 ,经pET 2e转化、IPTG诱导的受体菌可表达目的蛋白 ,克隆在硫氧还蛋白 (thioredoxinprotein ,TrxA)基因下游的E2蛋白基因与TrxA基因获得了高效融合表达 ,并且具有免疫学反应活性 ,这为猪瘟的血清学诊断方法的建立打下了基础 。  相似文献   

14.
斜纹夜蛾核多角体病毒VP39-GST融合蛋白的原核表达   总被引:2,自引:1,他引:1  
用PCR的方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus,SpltMNPV)vp39全长基因。将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达质粒pGEX-4T-vp39,转化大肠杆菌BL21(DE3),在1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导下超量表达了与理论预测值相符的一个约60 kD的VP39-GST融合蛋白。VP39-GST融合蛋白的成功表达为进一步研究VP39在病毒侵染过程中与宿主细胞成分或病毒粒子蛋白间的相互作用奠定了基础。  相似文献   

15.
旨在构建含融合基因pGMCSF-ORF2的重组腺病毒,并对其表达水平和免疫效果进行分析.运用PCR方法扩增PCV2 ORF2和pGM-CSF基因,拼接后克隆入pMD18-T载体,然后再亚克隆入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中,阳性穿梭质粒经PmeⅠ酶线性化后电转化含腺病毒基因组(AdEasy-1)的大肠杆菌细胞BJ5183-Ad-1,成功获得了重组腺病毒DNA.将纯化后的重组腺病毒DNA转染AD293细胞,经过病毒基因组的PCR和转录水平的RT-PCR及Western blot等方面对融合蛋白的表达进行了鉴定.以该病毒免疫Babl/c小白鼠,对免疫小鼠血清中PCV2抗体进行检测.结果显示,获得了pGMCSF-ORF2重组基因,重组腺病毒载体构建成功,获得了表达pGMCSF-ORF2融合蛋白的重组腺病毒.该病毒免疫小鼠后,在小鼠血清中检测到了PCV2的特异性抗体.获得的重组腺病毒能有效表达pGMCSF-ORF2融合蛋白,且可诱导小鼠产生针对PCV2的特异性抗体.  相似文献   

16.
从无花果曲霉(Aspergillus ficuum)3.4322中用RT-PCR方法扩增出一条约1.4kb的特异性条带,DNA序列测定表明,目的片段为不含信号肽的植酸酶编码序列,全长1347bp。无花果曲霉(Aspergillus ficuum)3.4322phyA基因序列已在GenBank注册(注册号为:AF537344)。将该基因克隆到酵母表达载体pYES2中,构建成不带信号肽phyA基因的重组表达载体pYPA2。用醋酸锂法将pYPA2转进urd缺陷型的酿酒酵母(s.oeraisiae INVSc1),筛选获得含植酸酶基因的酵母转化子。经半乳糖诱导表达后,用磷钼蓝显色(AMES)法对酵母菌体进行酶活测定,测出了明显的植酸酶活性,pYPA2胞内植酸酶活性约11.55IU/mL,表明无花果曲霉(Aspergillus ficuum)3.4322phyA基因能在酿酒酵母中表达。  相似文献   

17.
为构建单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV1TK)的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/HSV1TK,鉴定其在真核细胞中的表达和功能.以pORF-HSV1TK为模板,PCR扩增的目的基因HSV1TK片段与pMD18-T载体相连接构建重组克隆pMD18-T/HSV1TK.再双酶切出HSV1TK片段,插入pcDNA3.1-EGFP多克隆位点,构建pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK真核表达载体并进行酶切、测序鉴定[1].分别用荧光显微镜观察和RT-PCR方法检测脂质体介导pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK在卵巢癌细胞SKOV3的表达;分别用MTT法和光镜检测胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV1TK/GCV)系统对SKOV3体外杀伤作用及旁观者效应.结果表明,重组载体酶切鉴定结果与预期结果一致,基因序列与GenBank上报道的HSV1TK基因序列完全一致.荧光显微镜观察转染后的细胞发出绿色荧光;RT-PCR结果表明HSV1TK基因能在SKOV3内有效表达.MTT和光镜结果显示转染HSV1TK基因的SKOV3细胞,加入前体药物丙氧鸟苷(GCV)处理后对其有明显的杀伤作用和旁观者效应.成功构建的真核表达载体pcDNA3.1-EGFP/ HSV1TK能在SKOV3细胞中稳定表达,且HSV1TK对卵巢癌细胞株SKOV3体外有强大的杀伤作用和旁观者效应.  相似文献   

18.
根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.  相似文献   

19.
陈华萍  黄乾明  魏育明  郑有良 《遗传》2007,29(7):859-866
根据小麦低分子量谷蛋白基因保守区序列设计引物P1/P2, 采用PCR法对四川小麦地方品种AS1643的基因组DNA进行扩增, 获得1条约900 bp的片段, 分离、纯化后连接到载体pMD18-T上, 对筛选阳性克隆测序, 获得1个低分子量谷蛋白基因LMW-AS1643(GenBank登录号: EF190322), 其编码区长度为909 bp, 可编码302个氨基酸残基组成的成熟蛋白。序列分析结果表明, LMW-AS1643具有典型的低分子量谷蛋白基因的基本结构, 其推导氨基酸序列与其它已知的LMW-GS相比, 最高相似性为93.40%。生物信息学分析表明, 在LMW-AS1643低分子量谷蛋白中, 无规则卷曲含量最高, 为67.90 %, 其次是a-螺旋, 占30.46 %, b-折叠含量最少, 为1.64 %。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号