正交试验法确定测定意大利蜜蜂头部乙酰胆碱酯酶反应的最佳条件

用正交试验法研究了酶浓度、底物浓度、反应体系的pH值、反应温度和反应时间5个因素对测定意大利蜜蜂Apis mellifera ligustica Spinola头部乙酰胆碱酯酶(AChE)活性的影响, 并从试验组合中选出最佳条件。蜜蜂AChE活性的测定采用Gorun(1978)改进的Ellman方法, 以碘化硫代乙酰胆碱(ATCI)为底物, 5, 5' 二硫双硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂, 测定反应物在412 nm波长下的光密度值, 用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量, 经计算得到蜜蜂头部AChE的比活力。对正交试验结果进行极差分析和方差分析, 结果表明各因素对实验结果影响的大小顺序为：温度＞pH值＞时间＞酶浓度＞底物浓度。并得出测定蜜蜂头部AChE活性的最佳条件是：酶终浓度0.2头/mL、底物终浓度0.8 mmol/L、pH值7.5、温度40℃及反应时间5 min。     

剑麻蛋白酶的分离纯化及其部分特性的研究

采用乙醇分步沉淀和 DEAE-纤维素柱层析,可从剑麻 Agave sisalana 叶汁中分离到一个均一的蛋白酶组分,其结晶为平面六边形。该酶可为半胱氨酸和 EDTA 所激活,受 PCMB(p-chloromercuribenzoatc)、DTNB(5,5′-dithiobis(2-nitrobenzoic acid))及 Hg~(2 )、Ag~( )、Cu~(2 )的可逆抑制和碘乙酸(pH 7.5)的不可逆抑制。该酶以酪蛋白为底物时,酶反应的最适 pH 值约为7.5,最适温度为50℃,Km 值为0.0625%酪蛋白,该酶在45℃(含45℃)以下较为稳定。且在6.0—10.0的 pH 值范围内稳定。     

氧化还原对成年大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道的调控作用

采用膜片钳内面向外式记录技术,研究急性分离成年大鼠海马CAl区锥体神经元外向整流氯离子通道的氧化还原调控。发现细胞内侧给予氧化剂DTNB(5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid),可显著减弱氯通道的活动,IC50值为(28.05±2.42)μmol/L;还原剂DTT(dithiothreitol)对氯通道没有明显影响,但可逆转DTNB引起的抑制效应。说明DTNB不改变通道电导,其引起的通道活动减弱是由氯通道关闭时间延长而开放时间缩短所致。研究还发现,另一对氧化型和还原型谷胱甘肽具有与DTNB和DTT同样的效应。本研究结果显示,成年大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯通道可以被细胞内氧化还原剂所调控。     

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶激活和抑制状态的进一步研究

蛇肌果糖1,6-二磷酸酯酶(FruP_2ase)在K~+存在下或经枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶限制性酶解后,其中性pH的活力均有2倍或2倍以上增加。三种高活性形式的酶其紫外差光谱都同酶在尿素中的差光谱峰形基本一致。它们在受底物抑制的阈值、Mg~(2+)活化行为、K_m值、最适pH、同DTNB反应的能力以及巯基修饰后酶活力的变化等方面均有明显不同。说明三种高活性形式的酶构象呈松弛状态,但是在构象上是有差别的。受AMP抑制的酶2个快速反应巯基被DTNB修饰后,其pH7.5活力增加到对照酶活力的2.5倍,在这种条件下可反应的总巯基数为4,这时酶仍可保持在高活性状态。而底物抑制的酶,则观察不到快反应巯基,这种条件下,可反应的总巯基数为14。说明受AMP抑制的酶的构象比受底物抑制的酶的构象更为紧凑。     

果糖-2,6-二磷酸对番茄果实PFP酶活化效应的巯基依赖性

在无二硫苏糖醇(DTT)存在下得到部份纯化的氧化型PFP酶,在广泛的pH范围内(pH6.0～9.0)失去其大部分对果糖2,6-二磷酸的敏感性。活化效应可藉与DTT保温得到恢复而不改变其最适pH值。在与DTT保温过程中,酶对果糖2,6-二磷酸的亲和力逐步增加。氧化型酶的K_a值(对果糖2,6-二磷酸)在酶与DTT保温(pH8)1h之后从1400nmol/L下降到约50nmol/L。 在DTT存在下纯化的酶(还原型)经低浓度5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)处理,在使酶活性迅速失活的同时引起酶对果糖2,6-二磷酸脱敏。这一过程可为DTT处理所回复。从小麦胚中纯化的硫氧还蛋白h在恢复酶活性和酶的果糖2,6-二磷酸敏感性的效应中表明,细胞内的氧化还原状态可能藉以改变酶对果糖2,6-二磷酸的亲和力而调节PFP酶的活性。     

人胎盘谷胱甘肽S-转移酶中巯基的研究

 用巯基试剂5.5'-二硫双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)测得人胎盘谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)的总巯基数为每亚基2个,均为表面巯基,,其中一个与DTNB反应快,被修饰后可导致酶活力全部丧失。另一巯基与DTNB反应较慢,可能与酶活力无关。用在12℃测定剩余巯基和Stallcup-Koshland作图法求得DTNB修饰快反应和慢反应巯基的速度常数分别为44056和162min~(-1)(mol/L)~(-1)。底物谷胱甘肽的衍生物S-正辛烷谷胱甘肽(S-o-GSH)能保护GST-π能保护的快反应巯基免受DTNB的修饰,使反应速度常数随着S-o-GSH浓度的增高而降低。S-o-GSH也能保护酶被N-乙基马来酰亚胺(NEMI)修饰失活,但不能保护慢反应巯基被DTNB修饰。另一底物2,4-二硝基氯苯(CDNB)对NEMI的修饰失活没有保护作用。上述结果提示快反应巯基参与GST-π和谷胱甘肽的结合,是组成活性中心的重要基因。     

模拟酸雨对杜仲叶氮代谢的影响

 探讨了春夏两季模拟酸雨对杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)叶氮代谢的几个关键酶及相关物质含量的影响。结果表明：春夏两季杜仲叶硝酸还原酶(NR)、谷酰胺合成酶(GS)、谷氨酸脱氢酶(GDH)和谷丙转氨酶(GPT)活性在一定pH值酸雨胁迫下随酸雨pH值的降低而降低,夏季各酶活性下降率比春季高。杜仲叶可溶性蛋白质和总氮含量春夏两季也随酸雨pH值降低而降低(夏季可溶性蛋白含量与pH值呈正相关),总游离氨基酸含量则随pH值的降低而升高(二者呈负相关)。由此可见,酸雨对杜仲叶氮代谢产生了显著影响。     

初始pH值对碱性和酸性水稻土微生物铁还原过程的影响

酸碱度(pH值)是水稻土铁还原过程的重要影响因素之一。通过模拟水稻土淹水厌氧培养,以Al2(SO4)3和Na2CO3溶液分别调节碱性和酸性水稻土pH值至强酸性(pH值5.0)、酸性(pH值5.0—6.5)、中性(pH值6.5—7.5)、碱性(pH值7.5—8.5)、强碱性(pH值8.5),以此来研究5种初始pH值对水稻土泥浆铁还原过程的影响;通过微生物群落厌氧培养研究了2种水稻土菌悬液在6种pH值条件下的铁还原能力差异。结果表明,碱性水稻土铁还原潜势(a)、最大铁还原速率(V max)随初始pH值的降低而下降,而达到最大铁还原速率所需的时间(T Vmax)则延长。提高酸性水稻土初始pH值使铁还原V max增加而T Vmax缩短,但土壤中无定形氧化铁均能还原,初始pH值与V max具有显著正相关关系。碱性和酸性水稻土的土壤菌悬液在试验pH值范围内厌氧培养,其铁还原能力在培养初期差异不显著,但培养后期的差异明显,且最终都能把培养液中氧化铁完全还原。随着初始pH值升高T Vmax延长,V max则降低,且均显著负相关,但碱性水稻土微生物群落的V max在pH值6.00时最大。初始pH值和土壤类型对水稻土铁还原过程具有显著影响,且对土壤菌悬液微生物群的铁还原具有一定影响。     

在大肠杆菌中合成的萤火虫荧光素酶的分离和性质

用生物工程技术将萤火虫荧光素酶基因转移到大肠杆菌,在大肠杆菌中合成荧光素酶。这种工程菌已可通过发酵大量培养,并从菌体分离得到接近纯化的荧光素酶。这种酶的分子量是103kD;巯基试剂5,5’-巯基-2(2-硝基苯甲酸)“DTNB”能抑制酶的活性;对于底物荧光素的K_m为1.2μmol/L;酶反应最适pH为7.77;酶催化的生物发光峰在560nm。     

番茄果实ACC合成酶的性质

测定了经4步纯化、比活性达20000U／mg蛋白质以上的番茄果实伤诱导ACC合成酶的一些酶学性质。酶反应最适PH值为9．5;酶在pH8．0下最稳定,pH7．5－10短时间处理不会使酶发生不可逆变性;酶在pH8．0和9．5的Km值分别为23和4Dμmol／L;根据酶反应不同时间的产物累积量,得出反应速度随时间的变化符合函数关系式Vt＝V0e－kt,并根据此式求出酶的半寿期为107min。光照对酶活性有抑制作用。酶的DTNB化学修饰结果表明,在酶活性中心的PLP结合部位很可能有半胱氨酸残基存在。