甲基对硫磷水解酶的重组表达及其纯化和性质研究

用PCR方法获得甲基对硫磷水解酶编码基因,构建了重组表达质粒pET29a_mpd,将其转化至Escherichia coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,得到C末端含有6个寡聚组氨酸的甲基对硫磷水解酶,用NiNTA亲和层析纯化得到具有活性的甲基对硫磷水解酶。测定了环境因素对酶活性的影响及酶动力学参数。甲基对硫磷水解酶水解甲基对硫磷时,最适pH86～8.8,最佳反应温度15℃;Mn2+、Zn2+、Cu2+可使酶活性增加15%～20%,Ca2+、Mg2+微弱地促进酶的作用,Ni2+对酶活性几乎无影响;1mmol/L EDTA·Na2+几乎不影响酶的活性,而10mmol/L EDTA·Na2+对甲基对硫磷水解酶有较强的抑制作用。甲基对硫磷水解酶水解乙基对硫磷时,最适pH86。25℃时,该酶对甲基对硫磷的米氏常数Km为（68.6 ± 5.1）μmol/L,kcat为（45 ± 6 ）S-1;对乙基对硫磷的米氏常数Km为（59.5 ± 6.0）μmol/L,kcat为（8 ± 1） S-1。Kcat/Km表明甲基对硫磷水解酶对甲基对硫磷的催化效率更高。     

鲤春病毒血症病毒糖蛋白酵母表面展示系统的建立

糖蛋白(Glycoprotein, G)作为鲤春病毒血症病毒(Spring Virernia of Carp Virus, SVCV)主要的抗原蛋白, 已成为现阶段SVCV病毒检测、抗体制备以及疫苗研制的热点。为了对其进行酵母表面展示, 研究以SVCV-shlj1分离株基因组为模板, 通过RT-PCR技术, 体外扩增获得SVCV表面糖蛋白的基因开放阅读框(1530 bp)片段, 将其克隆至酵母表面展示载体pYD1, 构建重组质粒pYD1-G。利用电转化方法将重组质粒pYD1-G导入酿酒酵母EBY100感受态细胞, 经YNB选择培养基筛选和菌液PCR的鉴定, 挑选出阳性转化子(命名为EBY100-pYD1-G), 对其进行2%半乳糖诱导。利用细胞免疫荧光和流式细胞仪检测G蛋白的酵母表面展示情况。细胞免疫荧光结果显示, 诱导后的酵母细胞EBY100-pYD1-G能产生特异性红色荧光, 且随着诱导时间的增加, 红色荧光的酵母细胞所占比例不断增加, 各组之间差异显著(P< 0.05)。流式细胞仪检测结果显示, 酵母细胞的荧光强度与诱导时间呈正比, 其中诱导48h与72h的酵母细胞荧光强度不存在显著差异, 基本趋于稳定不变的状态。因此, 选取诱导48h为酵母表面展示的最佳诱导时间。上述研究结果表明SVCV的G蛋白已经成功展示于酿酒酵母细胞表面, 研究为鲤春病毒血症酵母口服疫苗的研发奠定了前期基础。     

甲基对硫磷水解酶基因的克隆与融合表达

利用鸟枪法从甲基对硫磷降解菌DLL-1 Peudomonas putida）中克隆了甲基对硫磷水解酶基因(mpd)片段2．5kb,并进行了测序。通过软件分析开放阅读框和启动子序列,表明该序列中最可能为甲基对硫磷水解酶结构基因的阅读框为769—1794区域。软件分析还表明该水解酶前端45个氨基酸为典型的信号肽结构。通过PCR扩增了mpd结构基因,亚克隆到表达载体pET—32a中,构建了完整的融合表达载体pET—MP。转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下2～4h甲基对硫磷水解酶表达可以达到最高水平;同时还研究了乳糖的诱导效果,2％乳糖诱导2h就可以起到很好的效果。通过PCR反应验证了mpd基因定位于DLL-E4的染色体而不是质粒上。     

耐盐及苯乙酸、甲基对硫磷降解基因工程菌的构建

H1（Halomonas sp.）是一株耐高盐浓度（18% NaCl, W/V）和降解苯乙酸的菌株,pDT3质粒为pUC19插入甲基对硫磷水解酶基因（mpd基因）构建而成。采用ＨindⅢ酶切,获得含有完整mpd基因片段,克隆到广宿主质粒pKT230和pBBR1MCS2上,构建成质粒pKTMP和pBBRMP。通过三亲杂交,在辅助质粒pRK2013的帮助下,将质粒pKTMP和pBBRMP转移到Ｈ１中,得到的工程菌HpKTMP和HpBBRMP具有耐盐、降解苯乙酸和水解甲基对硫磷的功能,其中HpBBRMP水解酶活性与亲本菌株甲基对硫磷降解菌（Pseudomonas putida）DLLE4相当,而HpKTMP水解酶活性要提高1倍左右。经过传代试验,证明了工程菌的稳定性。     

环糊精葡萄糖基转移酶的酿酒酵母表面展示及其生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸

摘要:【目的】将环状芽孢杆菌251(Bacillus circulans 251)来源的环糊精葡萄糖基转移酶(Cyclodextrin Glycosyltransferase,CGTase)展示在酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)细胞表面,构建全细胞催化剂生产2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(2-O-α-D-glucopyranosyl-L-ascorbic acid,AA-2G),以提高AA-2G 的产量。【方法】将CGTase编码基因cgt连接到载体质粒pYD1中的a凝集素(a-agglutinin)Aga2p亚基基因的下游构建表面展示重组质粒pYD1-cgt,转化酿酒酵母EBY100获得重组菌EBY100-pYD1-cgt,对发酵条件(培养基、诱导温度和诱导剂半乳糖浓度)进行优化;同时先后对重组菌的发酵产酶以及表面展示CGTase的酶促合成AA-2G的条件进行了优化;进一步又比较了表面展示的CGTase与E.coli BL21发酵所得的游离CGTase在酶促制备AA-2G过程中副产物的积累情况。【结果】展示CGTase的酿酒酵母重组菌株以YPG培养基作为发酵培养基,诱导剂半乳糖初始添加浓度为20 g/L,经25 ℃诱导48 h后,表面展示CGTase最大酶产量为0.5 U/mL;表面展示CGTase 40 ℃条件下的温度稳定性比游离酶有所提高,pH稳定范围变宽。对表面展示的CGTase制备AA-2G转化条件的优化发现,其最适温度最适pH分别为30 ℃和4.5,转化48 h达到平衡,表面展示的CGTase制备AA-2G的产量较游离酶提高了37%。【结论】对于CGTase,a凝集素系统是一个有效的展示系统,构建的酿酒酵母全细胞催化剂用于酶促制备AA-2G时,产生的副产物葡萄糖可能被酵母细胞利用,从而降低了葡萄糖与VC的竞争作用使AA-2G的产量增加,该全细胞催化剂具有良好的应用前景。     

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的表面展示及酶学性质

【目的】构建疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)在毕赤酵母GS115中的细胞表面展示体系,筛选展示成功且酶活力及展示率较高的重组子作为全细胞催化剂,并研究其酶学性质。【方法】克隆TLL基因tll,以酿酒酵母细胞壁蛋白Sed1p为锚定蛋白,构建表面展示载体pPICZαA-TLS。重组载体经SacⅠ线性化后转入毕赤酵母GS115中,经三丁酸甘油酯平板检测及摇甁发酵筛选获得高酶活力的毕赤酵母重组子,采用抗FLAG标签一抗和R-PE荧光素标记的二抗处理细胞后,进行荧光显微镜检测和流式细胞仪分析,并考察全细胞催化剂的最适反应温度和pH、金属离子耐受性等酶学性质。【结果】成功构建TLL毕赤酵母细胞表面展示体系,筛选到1株具有三丁酸甘油酯和橄榄油水解活力的克隆子,经1%的甲醇诱导发酵120 h后,水解橄榄油酶活力达257.8 U/g干细胞。经抗体处理后的重组菌发酵细胞在荧光显微镜下呈现强烈的红色荧光,流式细胞仪分析结果也证实脂肪酶被成功展示在酵母细胞表面,展示率达98.36%。展示的TLL作为全细胞催化剂水解对硝基苯酚丁酸酯(pNPB)的最适温度为30℃,最适pH为8.0,且具备良好的热稳定性和有机溶剂耐受性;K+、Ca2+、Mg2+对其有微弱的激活作用,Mn2+、Ni2+则有微弱的抑制作用,Cu2+的抑制作用较强,而EDTA、SDS、Tween 20对酶活力影响不明显。【结论】首次将TLL脂肪酶成功展示在毕赤酵母细胞表面,获得具有较高水解活力和良好酶学特性的全细胞催化剂,为表面展示TLL脂肪酶的规模化应用奠定了技术基础。     

酿酒酵母表面展示鲑鱼降钙素多肽的研究

目的:实现酿酒酵母表面展示鲑鱼降钙素.方法:人工合成鲑鱼降钙素(Salmon cacitonin,sCT)编码基因,克隆到表面展示载体M-pYD1上.用NocⅠ酶切重组质粒M-pYD1-sCT和空白质粒M-pYD1,回收sCT和V5表达框片段后分别以LiAC法转化酿酒酵母EBY100菌株,分别得到重组酵母yAGA2-sCT和yAGA2-V5.两种重组酵母分别经半乳糖诱导表达后,采用FITC荧光标记酵母表面展示的sCT和V5多肽,分别用荧光显微镜和流式细胞仪进行定性和定量分析.结果:诱导12h后,荧光显微镜下清晰观测到了工程菌表面有重组sCT,流式细胞分析结果表明10000个细胞中65.2%的yAGA2-sCT菌株表达了外源sCT,52.4%的yAGA2-V5菌株表达V5.结论:利用酿酒酵母表面展示鲑鱼降钙素多肽获得了成功,为口服型鲑鱼降钙素的研发奠定了基础.     

南极假丝酵母脂肪酶A的表面展示及酶学性质研究

采用a凝集素作为载体蛋白,首次将南极假丝酵母脂肪酶A展示在酿酒酵母细胞表面,通过MD平板筛选获得表面展示型的CALA酵母工程菌株。免疫荧光检测显示CALA被成功展示在酵母细胞壁表面,重组子经诱导后能在三丁酸甘油酯板上形成透明圈,说明展示的CALA具有活性。重组酵母在液体培养基培养72 h,活性达到最高,为80.4 U/g干细胞。酿酒酵母展示的CALA最适温度及pH值为70°C和pH 8.0。经50°C保温2 h,仍含有60%水解酶活力。展示的CALA在pH 7.0和pH 8.0溶液中比较稳定。经DMSO处理2 h,展示的CALA仍保持70%的活性。以上结果表明酵母展示的CALA可作为一种有潜质商业用途的全细胞催化剂。     

利用a凝集素在酿酒酵母表面展示解脂耶氏酵母脂肪酶Lip2

[目的]将解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2展示在酿酒酵母表面,构建全细胞催化剂.[方法]采用PCR方法扩增得到解脂耶氏酵母胞外脂肪酶Lip2成熟肽编码基因LIP2,将其连接到AGA2基因的下游构建表面展示载体pCTLIP2.分别以橄榄油、三丁酸甘油酯和对硝基苯酚棕榈酸酯(pNPP)为底物检测展示的脂肪酶酶活.在此基础上,对野生菌及工程菌的酶学性质进行比较.[结果]展示Lip2的酿酒酵母重组菌株在半乳糖的诱导下,表现出水解橄榄油、三丁酸甘油脂以及pNPP的活性,20℃诱导72h时酶活达到最高,为182 U/g干细胞.对展示的Lip2的酶学性质研究表明,其最适温度为40℃,最适pH为8.0,温度稳定性比自由酶有所提高,50℃温浴4 h后残余酶活为其最大酶活的23.2%.以不同碳链长度的对硝基苯酚酯为底物检测其底物特异性,结果显示其水解C8,C12,C16对硝基苯酚酯活性相近,均远高于对硝基苯酚丁酸酯(C4)的水解酶活.[结论]对于Lip2,a凝集素系统是一个有效的展示系统,利用该系统成功将Lip2展示在酿酒酵母表面,从而构建了酿酒酵母全细胞催化剂,该全细胞催化剂具有良好的潜在应用前景.     

假单胞菌WBC-3甲基对硫磷水解酶性质的初步研究

从最近分离到的有机磷农药降解菌Pseudomonassp. WBC3中获得了甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase, MPH,EC 3183）。该酶在48h的培养物中分布比例分别为：上清液2.1%, 胞内862%和胞间质11.7%,说明MPH为胞内酶。经过Cmsepharose Fast Flow阳离子交换层析,获得电泳纯的酶。SDSPAGE和凝胶过滤层析表明,该酶为单体蛋白,分子量约为34kD。动力学分析显示该酶为非特异性有机磷降解酶,但最适底物为甲基对硫磷。在pH9～12范围,酶表现较高活力水平,最高活力的反应温度为40℃。根据各类金属离子和鳌合剂对酶活的影响,推测MPH为金属酶。