磁纳米颗粒标记脂肪干细胞向软骨分化及体外MRI示踪的实验研究

目的:探讨磁纳米颗粒(magnetic iron oxide particles,MIOP)体外标记脂肪间充质干细胞(ASCs)向软骨分化及MRI示踪的可行性。方法:从小鼠脂肪组织中分离培养、扩增脂肪间充质干细胞(ASCs),流式鉴定细胞表型后,分别采用不同浓度(25μg/mL,50μg/mL)的MIOP标记ASCs并向软骨细胞诱导分化。普鲁士蓝染色和透射电镜(TEM)鉴定细胞内磁纳米铁颗粒分布情况,应用3.0T MRI体外检测标记软骨细胞MRI信号。结果:从脂肪组织中可以分离获得大量高表达CD90、CD105、Sca-1的ASCs,不同浓度(25μg/mL,50μg/mL)的MIOP与ASCs共同孵育24小时后,普鲁士蓝染色发现ASCs随MIOP浓度的增加,蓝染程度逐渐加深且标记的ASCs可以向软骨细胞分化;TEM证实细胞内分布大量的黑色纳米铁颗粒。体外MRI T2序列证实随着MIOP浓度(25μg/mL,50μg/mL)的增加MRI信号值逐渐减低且具有统计学差异(P0.05)。结论:MIOP可以标记ASCs向软骨分化,体外应用MRI可以对其进行示踪。     

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记骨髓间充质干细胞实验研究

目的:研究不加转染剂,超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide,SPIO)对骨髓间充质干细胞(bonemarrow-derived mesenchymal stem cells,MSCs)的标记效果.方法:全骨髓法培养猪骨髓间充质干细胞,用50 ug/ml铁浓度的SPIO标记MSCs,普鲁士蓝染色鉴定标记效果,流式细胞仪测定标记MSCs的增殖及凋亡,台盼蓝染色检测标记细胞的活力.结果:不加转染剂,SPIO标记MSCs达100%,50 ug/ml铁浓度标记对MSCs活力、增殖及凋亡无影响.结论:不加转染剂,50 ug/ml铁浓度SPIO可安全、有效的标记MSCs.     

VEGF靶向分子探针的制备及对卵巢癌细胞SKOV3体外成像的初步研究

目的:制备分子探针VEGF-USPIO和研究其在体外对卵巢癌细胞的靶向成像作用。方法:采用化学偶联法将VEGF抗体与USPIO连接,构建成具有免疫活性的靶向分子探针VEGF-USPIO。用CCK-8法检测该探针对卵巢癌细胞株SKOV3细胞活性的影响;普鲁士蓝染色法检测细胞磁性标记情况,并对经过标记的细胞进行体外磁共振成像,观察其对磁共振信号强度的影响。结果:成功合成了分子靶向探针VEGF-USPIO;当探针浓度在60μg/mL及以下时对细胞活性无影响(P0.05);细胞普鲁士蓝染色结果显示标记了靶向探针VEGF-USPIO的细胞其胞膜及胞浆含铁颗粒沉积较多;细胞体外磁共振成像结果显示经靶向探针标记的细胞,T2WI信号强度较未标记探针的对照组细胞降低(P0.05)。结论:所合成的VEGF-USPIO通过磁共振信号强度的变化实现MRI成像。     

三种不同转染剂介导钆喷酸葡胺标记人脐带间充质干细胞及体外MR成像的实验研究

人脐带组织富含间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）,是干细胞研究理想的种子来源,如何从脐带组织中分离间充质干细胞及运用影像技术示踪干细胞生物学行为是当前研究的热点。该实验应用组织块贴壁法从足月孕妇脐带组织中分离纯化间充质干细胞并进行鉴定,结果为hUCMSCs。进一步应用磷酸钙、Effectene、脂质体2000三种转染试剂分别介导Gd-DTPA标记hUCMSCs,通过MRI（magnetic resonance imaging）检测钆喷酸葡胺（Gd-DTPA）标记细胞信号强度变化及细胞内钆离子浓度的测定评价三种转染试剂的转染能力,最终发现在三种转染试剂中,Effectene介导Gd-DTPA标记hUCMSCs效果最佳,为Gd-DTPA标记干细胞体外MR成像奠定了实验基础。     

荧光磁性纳米粒子标记间充质干细胞靶向胃癌研究

目的:探索一种高效的早期胃癌诊断体系.方法:荧光磁性纳米粒子与间充质干细胞共培养,不同时间点检测干细胞存活率.利用荧光显微镜、普鲁士蓝染色、透射电子显微镜等方法观测干细胞被标记情况;建立裸鼠的胃癌模型,并将标记后的干细胞尾静脉注射入裸鼠体内,14d后用动物成像仪和核磁共振成像仪检测.结果:荧光磁性纳米粒子在低于 100μg/mL浓度下对间充质干细胞没有毒性作用,荧光磁性纳米粒子与干细胞共培养6h后,荧光显微镜、普鲁士蓝染色、透射电子显微镜检测结果显示粒子被内吞后定位于细胞质中,动物实验显示通过检测肿瘤部位的荧光信号和核磁信号,被标记的干细胞能够准确定位到胃癌的发生部位.结论:这种双模式检测体系为胃癌的早期诊断与治疗提供一种新的方法.     

人脐带间充质干细胞食蟹猴连续静脉输注后免疫毒性与免疫调节作用研究

该文旨在研究人脐带间充质干细胞在食蟹猴体内的免疫毒性与免疫调节特性。连续14天给予食蟹猴不同剂量(2.0×10~6个·kg~(-1)和2.0×10~7个·kg~(-1))的人脐带间充质干细胞静脉滴注,检测食蟹猴血清IgG浓度、抗人脐带间充质干细胞抗体、淋巴细胞活化增殖和T细胞亚群的变化,以及胸腺和脾脏组织学变化。结果显示,连续14天静脉给予人脐带间充质干细胞对食蟹猴血清IgG浓度无影响,不刺激动物产生抗人脐带间充质干细胞抗体。人脐带间充质干细胞显著抑制食蟹猴淋巴细胞的活化增殖,降低CD3~(+)T细胞比例,刺激Treg细胞的增殖分化。组织学检查发现,部分动物出现与给药相关的胸腺皮质萎缩和脾脏淋巴生发中心增多增大。该研究得出,人脐带间充质干细胞的免疫毒性极低,静脉输注后不引起食蟹猴体内免疫排斥等异常反应,提示其在临床上异体应用的安全性。     

硅化超顺磁氧化铁纳米颗粒标记人羊膜间充质细胞的效率及其对细胞增殖的影响

旨在探讨一种新型硅化超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记人羊膜间充质细胞的最佳方法, 并检测其对细胞增殖的影响. 用不同浓度的Si-SPIO和多聚赖氨酸混合制备PLL-Si-SPIO复合物, 标记体外培养的hAMCs. 利用普鲁士蓝染色和透射电子显微镜等方法对Si-SPIO的标记情况进行分析鉴定. 分析Si-SPIO标记后1~4周铁颗粒在细胞内的维持与稳定. 应用MTS分析法探讨经Si-SPIO标记后hAMCs的增殖活性. Si-SPIO标记后的hAMCs移植到小鼠纹状体内1周, 鉴定Si-SPIO阳性细胞的存活与分布. 观察发现, hAMCs经Si-SPIO标记后细胞内可检测到大量铁颗粒, 铁颗粒能在细胞内维持4周以上. Si-SPIO标记具有浓度依赖性, 最适浓度为20 µg/mL; 较低浓度的Si-SPIO对细胞增殖活力没有显著影响. 移植到小鼠脑内1周后可见Si-SPIO阳性细胞. 结果可知, 浓度为20 µg/mL的Si-SPIO标记hAMCs可获得良好的标记效果, 并且不影响细胞的增殖活力.     

新型慢病毒转染四种细胞及在体内示踪的研究

目的探讨最佳的生物标记方法示踪细胞,更好地观察细胞移植后在体内的归巢情况。方法本实验室用一种新型慢病毒(e GFP+PURO Lentivirus)转染了四种细胞,确定了四种细胞的最佳感染复数,细胞转染成功后,用最佳浓度的嘌呤霉素筛选,获得四种稳定的GFP阳性表达细胞株。所用的细胞包括人脐带间充质干细胞(h UC-MSC),树鼩脐带间充质干细胞(TS-UC-MSC),人胚肾细胞(293T),C57BL小鼠骨髓间充质干细胞(C57-BMSC)。结果用新型慢病毒(e GFP+PURO Lentivirus)成功转染四种常用细胞,转染成功率100﹪,细胞成功标记上GFP荧光,并确定了最佳的嘌呤霉素使用浓度,确定了不同细胞的感染复数。最终确定TS-UCMSC的最佳感染复数为240,h UC-MSC的最佳感染复数为150,293T的最佳感染复数为100,C57-BMSC的最佳感染复数为50。用带荧光的C57-BMSC细胞回输C57BL小鼠体内,冰冻切片在肝中找到标记细胞,在脾、肺、肾、心未找到标记细胞,说明外来细胞主要在肝脏中代谢。结论在细胞移植治疗时,细胞成功标记上GFP能在动物体内进行示踪,良好的细胞示踪方法可以很好地反映所研究细胞在体内外的动向。     

人羊膜间充质干细胞对四氯化碳诱导小鼠肝损伤定位修复的研究

目的:观察活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记的人羊膜间充质干细胞对四氯化碳诱导小鼠肝损伤模型的定位修复情况。方法:采用胰蛋白酶-胶原酶消化法从羊膜组织中分离间充质干细胞,通过流式细胞术和免疫荧光等方法进行鉴定。模型组按浓度为20μl/g剂量的四氯化碳和橄榄油混合液诱导小鼠肝损伤,治疗组经小鼠尾静脉注射羧基荧光素乙酰乙酸标记的人羊膜间充质干细胞约1×106个/ml。分别取模型组和细胞移植的治疗组小鼠眼球血和肝组织进行相关检测。结果:分离得到纯度较高的羊膜间充质干细胞;冰冻切片免疫荧光显示移植1周后细胞向小鼠受损肝组织定植,CFSE标记的人羊膜间充质干细胞呈绿色荧光;细胞移植后4周,与模型组比较,细胞移植组小鼠血清中天冬氨酸转移酶、丙氨酸氨基转移酶显著降低,而白蛋白明显升高(P0.01);肝组织病理切片模型组小鼠细胞水肿,坏死灶多见,脂肪变性,可见不同程度的炎性细胞浸润;治疗组小鼠肝组织病理学改变和损伤程度有较明显改善;小鼠肝组织冰冻切片的免疫荧光显示移植4周后人羊膜间充质干细胞周围分泌血清白蛋白。结论:羧基荧光素乙酰乙酸标记的人羊膜间充质干细胞可有效改善肝组织的生理功能,为细胞定位移植治疗肝脏疾病的修复情况提供实验数据。     

多模式追踪食蟹猴骨髓间充质干细胞

近年来, 在细胞治疗和再生医学领域, 自体或异体细胞移植治疗疾病正在成为现实. 骨髓间充质干细胞具有分化成多种细胞的潜能, 已被广泛用于各种疾病的研究和治疗. 活体追踪移植细胞, 检测移植细胞的生存及功能状态对于评价移植治疗效果至关重要. 目前, 利用磁共振对比剂超顺磁性氧化铁颗粒(SPIO), 活体追踪和监测标记细胞已被广泛用于动物实验研究和一些临床疾病诊断. 但 MRI 信号不能显示移植细胞在体内的生物学特征. 本研究中, 对食蟹猴骨髓间充质干细胞体外标记Molday ION rhodamine-B^TM(MIRB), 探讨MIRB 标记后cMSCs 的细胞生物学特性, 以及脑内移植后的活体MRI 影像学及组织学追踪. 结果表明, MIRB 具有生物组织相容性, 能高效标记cMSCs, 可用于体内多模式追踪移植细胞, 为利用MIRB 追踪和检测移植细胞, 以及干细胞移植治疗机制的研究提供资料.