转天山雪莲冷调节蛋白基因烟草的获得及其抗寒性鉴定

从已建立的天山雪莲cDNA文库中随机挑取单克隆,采用通用引物M13扩增出基因序列并测序,然后将该序列在GenBank中进行比对,根据该序列设计特异引物进行PCR,最终获得了冷调节蛋白基因siCOR的完整开放读码框(ORF);构建植物表达载体,通过农杆菌介导法获得转基因烟草,用RT-PCR对转化烟草进行鉴定,收取种子后筛选出纯合的T3株系,并通过冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果表明:(1)siCOR大小661bp,与禾本科植物粳稻的冷调节蛋白基因一致性最高(65.04%)。(2)与野生型植株相比,转siCOR基因烟草均叶片浓绿、无分支侧芽,生长快;在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因的烟草叶片相对含水量、PSⅡ相对量子产率降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均低于野生型烟草植株,而且转siCOR基因烟草植株叶片出现萎蔫症状的时间较迟、程度较轻,受到的伤害也较轻。研究发现,在冷冻胁迫条件下,转siCOR基因烟草植株表现出良好的生理和生长优势,显示出了较强的抗寒特征。     

天山雪莲SiICE2基因克隆及抗寒性分析

该研究以天山雪莲(Saussurea involucrata)的转录组数据为基础,利用Premier 5.0设计1对特异性引物SiICE2-Up和SiICE2-Down,以天山雪莲cDNA为模板克隆得到天山雪莲SiICE2基因的开放阅读框(ORF),对其进行生物信息学分析;构建植物表达载体pCAMBIA2300-35S-SiICE2-Nos,利用农杆菌介导法导入番茄(Lycopersicon esculentum),通过PCR和RT-PCR对转化植株进行验证,qRT-PCR分析转SiICE2基因番茄株系SiICE2基因的相对表达量;将转SiICE2基因型和野生型番茄在0℃处理后,进行抗寒性分析。结果表明:(1)成功克隆得到天山雪莲SiICE2基因,其大小为462bp,共编码153个氨基酸,系统进化分析发现SiICE2蛋白与菜蓟(Cynara scolymus L)亲缘关系最近。(2)成功构建了植物表达载体pCAMBIA2300-35S-SiICE2-Nos,经农杆菌介导法侵染番茄,PCR鉴定表明共有9株为转SiICE2基因番茄植株。(3)膜生理指标测定结果显示,随着低温处理时间的增加,转SiICE2基因型番茄的相对电导率、丙二醛含量均显著低于野生型,在处理时间为24h时,转SiICE2基因型番茄相对电导率比野生型低31.7%,丙二醛含量比野生型低4.2μmol/g。(4)抗氧化酶活性测定结果显示,随着低温处理时间的增加,转SiICE2基因番茄植株的POD、CAT和SOD活性均呈现持续递增趋势,野生型呈先逐渐升高后降低的趋势,且各处理时间内转SiICE2基因番茄的POD、CAT和SOD活性均显著高于野生型。研究发现,天山雪莲SiICE2基因可以显著增强非低温驯化番茄的抗寒性。     

天山雪莲冷调节蛋白基因siCOR转化烟草植株的抗旱性分析

冷调节蛋白(cold regulated proteins, CORPs)是植物在冷驯化下产生的特异性蛋白, 与植物的抗寒性密切相关。然而, 大量研究表明, 绝大多数植物冷诱导基因同样会响应水分胁迫。采用半定量RT-PCR分析天山雪莲(Sasussured involucrata)冷调节蛋白基因siCOR的表达, 结果表明siCOR是一个受干旱胁迫诱导表达的基因。为研究siCOR基因是否与抗旱性相关, 以siCOR转基因烟草为研究材料, 利用水分胁迫处理进行抗旱性分析。结果表明与野生型(wild-type, WT)相比, 转siCOR植株叶片萎蔫较迟且程度较轻, 复水后恢复快且较完全; 其叶片相对含水量和PSII相对量子产率的降低幅度、相对电导率和丙二醛含量的升高幅度均低于野生型烟草植株。采用PEG6000模拟干旱胁迫, 发现转siCOR植株T3代种子的萌发率较高, 主根生长的受抑制程度较野生型轻。以上结果表明, siCOR基因在植物对干旱胁迫的响应中起重要作用。     

转天山雪莲sikPIP3基因烟草的获得及抗逆性鉴定

利用PCR技术从实验室建立的天山雪莲DNA文库中克隆了天山雪莲质膜水孔蛋白基因sikPIP3,构建了植物表达载体pBI121-sikPIP3,通过农杆菌介导法转化烟草品种NC89,经PCR和RT-PCR检测证明目的基因成功导入并得到了表达,采用水分胁迫进行抗旱分析和采用冷冻胁迫进行抗寒性分析。结果显示:(1)克隆出具有水孔蛋白基因特性的sikPIP3基因。(2)经断水干旱处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在断水9d的情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草萎蔫症状较轻;生理指标测量结果显示,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,相对含水量和CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗旱性高于野生型烟草。(3)经不同温度胁迫处理,转基因烟草的生长表型优于野生型烟草,特别是在-4℃冷处理6h情况下,野生型烟草已经完全萎蔫,转基因烟草只出现少量伤斑;生理指标分析结果表明,转基因烟草的相对电导率和MDA的含量低于野生型烟草,CAT活性高于野生型烟草。试验表明转sikPIP3烟草的抗寒性高于野生型烟草。综合结果表明:sikPIP3基因在抗逆基因工程方面具有较高的应用前景。     

转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究

ICE1是CBF冷响应通道的上游转录调控因子,通过与CBF启动子中MYC顺式作用元件的结合激活CBF3基因表达.采用RT-PCR方法,从拟南芥获得AtICE1基因,将AtICE1导入pCAMBIA1301构建35S:AtICE1植物表达载体.通过根癌农杆菌GV3101,将AtICE1基因导人烟草,T1代植株经潮霉素抗性筛选,PCR、RT-PCR检测,结果表明AtICE1基因已经整合到烟草基因组中,并在转录水平表达;在正常生长条件下,转基因烟草与对照烟草的生长未见明显区别,而在瞬时低温冻害下,转基因烟草存活率明显高于对照烟草植株,说明Atl-CEI基因可以提高低温敏感作物的耐寒性.     

新疆天山雪莲体胚诱导与分化研究

以新疆天山雪莲的叶片为外植体,分别用不同配方培养基诱导愈伤组织,后进行体胚诱导和分化培养形成再生雪莲植株.结果表明,诱导愈伤组织的最适培养基为MS 2,4-D 0.5 mg/L BA 1.5 mg/L,诱导率可达到100%;愈伤组织转移至MS 2,4-D 0.5 mg/L BA 1.5 mg/L培养基进行继代培养,增殖后的愈伤组织转移到MS 2,4-D 0.2 mg/L的液体培养基后成功诱导出雪莲体胚,出胚率达40%;将体胚接至MS ABA 0.5 mg/L培养基后,结果分化生长出大量的再生雪莲幼苗.     

新疆雪莲DFR基因的分离及同源遗传转化

二氢黄酮醇4-还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）是植物重要的次生代谢产物花青素生物合成途径中的关键酶。运用RT-PCR和RACE技术从新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)中克隆得到DFR基因(GenBank登录号为JN092126)。DFR基因的cDNA全长序列含有1个1 029 bp的开放阅读框(ORF),编码343个氨基酸,该基因推断的蛋白与水母雪莲DFR基因推断的蛋白高度同源,相似性达到92%;以不同物种中DFR氨基酸序列进行比对分析,推断的蛋白含有与NADPH特异结合的结构域。将该基因运用农杆菌介导的叶片转化法进行同源转化,将含有转DFR基因的愈伤组织进行悬浮培养,紫外分光光度法测定愈伤组织的总黄酮含量,结果表明转基因愈伤组织的总黄酮含量明显高于非转基因愈伤组织的含量。该研究为提高新疆雪莲药用化学成分黄酮类物质及实现新疆雪莲花青素的人工生物合成的研究奠定基础,对解决天山雪莲资源匮乏提供参考。     

天山雪莲SikGLP基因的克隆及表达分析

从天山雪莲cDNA文库中分析得到一个类萌发素蛋白基因序列,命名为SikGLP。生物信息学分析表明,该基因包含1个633 bp的完整开放阅读框,编码210个氨基酸。SikGLP分子量为21.6 kDa,理论等电点是6.81,并且是具有信号肽的疏水性蛋白。氨基酸多序列比对发现GLP序列保守性较高,具有的GLP的典型特征。17个物种间的系统发育树可以看出与葡萄GLP进化关系最近。Real time-PCR检测表明,SikGLP基因受低温、甲基紫精和PEG诱导表达,可能在胁迫初期对提高植物防御起作用。     

天山雪莲未知蛋白基因的克隆及其耐铝特性分析

从天山雪莲叶片低温诱导的cDNA文库中克隆了一个未知蛋白基因(SikSD-82)cDNA全长序列。生物信息学分析表明SikSD-82基因共编码262个氨基酸,具有小麦铝诱导蛋白Wali7的保守结构域,属Gn_AT_Ⅱ家族的可溶性蛋白;其氨基酸序列与蓖麻的茎部特异性表达蛋白相似性最高为60.89%;进化树分析显示,该蛋白与番茄的茎部特异性表达蛋白关系最近。亚细胞定位结果表明,SikSD-82蛋白主要定位于细胞核。在铝胁迫条件下,转SikSD-82烟草幼苗根的伸长明显优于野生型,根部铝离子和丙二醛含量均显著低于野生型烟草,转SikSD-82烟草显示出较强的耐铝性。     

秋水仙素诱导天山雪莲四倍体的研究

利用组织培养附加秋水仙素的方法对濒危药用植物天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.)进行多倍体诱导,结果表明:(1)与种子作材料相比,采用秋水仙素处理无菌苗是获得天山雪莲多倍体植株的最佳途径.(2)二倍体植株的叶片薄、平展、较细长、色绿、尖齿不明显、根细长;经秋水仙素处理诱导得到的植株叶片变宽、变肥厚、叶色深绿,尖齿明显、根短粗.(3)染色体计数、气孔分析及流式细胞仪倍性综合检测表明,诱导得到的多倍体变异苗为纯合四倍体.     

甘肃小苏干湖盐沼湿地盐地风毛菊叶形态-光合生理特征对淹水的响应

盐沼湿地植物叶片功能性状对淹水的响应分析, 有助于探究植物叶片可塑性机制与光合生理特征间的内在关联性, 对深入理解盐沼湿地植物的生境抗逆性策略具有重要意义。根据小苏干湖湖水泛滥区静水持留时间长短分别设置: 轻度淹水区(静水持留30-90天)、中度淹水区(静水持留90-150天)、重度淹水区(静水持留150-210天) 3个试验样地, 以盐地风毛菊(Saussurea salsa)为研究对象, 研究了小苏干湖盐沼湿地盐地风毛菊叶片功能性状对淹水的响应。结果表明: 随着静水持留时间的增加, 轻度淹水区盐地风毛菊形态上采用小比叶面积(SLA)的肉质化小叶模式, 光合生理上具有高实际光合效率(Y(II))和低调节性能量耗散的量子产额(Y(NPQ))的协同变异; 重度淹水区盐地风毛菊形态和光合生理上则采用与轻度淹水区完全相反的协同变异策略; 在3个样地中, SLA与Y(II)、光化学淬灭(QP)和Y(NPQ)间均呈极显著相关关系; 叶绿素a含量和叶绿素b含量与调节性能量耗散的量子产额(Y(NO))均呈显著正相关关系。小苏干湖湖水泛滥区静水时空演变格局影响下, 盐地风毛菊种群通过改变叶面积、叶厚度和SLA等叶片形态特征, 适时调整叶片Y(II)和Y(NPQ)等光合生理特征, 实现植物叶片光合碳同化产物的收支平衡, 表现出对水盐异质性环境较强的耐受性, 反映了盐沼湿地植物在极端生存环境下的叶片可塑性和抗逆性机制。     

6个棉花品种幼苗对低温胁迫的响应

4 ℃低温条件处理6个不同熟性棉花品种幼苗,测定供试材料叶片中SOD活性、POD活性、超氧阴离子含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、MDA、相对电导率以及根系活体染色等8项指标,比较不同棉花品种苗期抗冷性差异.对测定指标进行综合评价结果显示：4 ℃低温胁迫1 d后,6个品种耐冷性由强到弱依次为中50＞N203＞N52＞K-1＞N181＞N177;4 ℃低温胁迫2 d后,耐冷性顺序为中50＞N177＞N52＞K-1＞N203＞N181;4 ℃低温胁迫3d后N52＞中50＞N203＞K-1＞N177＞N181.各生理指标综合评判结果为早熟品种中50和N52耐受性较强.     

利用低温水浴鉴定水稻苗期耐寒性

高效准确鉴定苗期耐寒性是水稻(Oryza sativa)耐寒研究的前提。基于流动水浴温度均一这一特性, 建立了一种恒温水浴鉴定水稻幼苗耐寒性方法。该方法中环境温度设定为20°C, 水浴温度设定为4°C。根据对2个水稻亚种不同材料的处理结果, 总结出几种常见品种的低温处理时间与存活率参考值, 并对操作过程中的一些注意事项进行了说明。     

利用低温水浴鉴定水稻苗期耐寒性

高效准确鉴定苗期耐寒性是水稻(Oryza sativa)耐寒研究的前提。基于流动水浴温度均一这一特性, 建立了一种恒温水浴鉴定水稻幼苗耐寒性方法。该方法中环境温度设定为20°C, 水浴温度设定为4°C。根据对2个水稻亚种不同材料的处理结果, 总结出几种常见品种的低温处理时间与存活率参考值, 并对操作过程中的一些注意事项进行了说明。     

不同地理种群狗牙根耐寒性研究

低温是狗牙根冬季生长的主要限制因素,越来越引起草业工作者的重视.以收集于我国不同地理种群的野生狗牙根为试验材料,探讨低温对不同种群狗牙根草坪质量和生理反应的影响,为抗寒栽培和耐冷育种提供理论和实践支持.结果表明:起源于高纬度狗牙根耐寒性最强,低纬度最差.起源纬度与狗牙根的耐寒性、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量具有极显著的相关性,与过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性具有显著的相关性,而与草坪质量、超氧化物岐化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素含量的相关性不显著.