蛇足石杉离体培养产生有效成分的研究

本研究报道了以庐山野生蛇足石杉成年株新生枝茎为外植体,运用植物离体培养技术获得了产生石杉碱甲的叶状体。实验结果表明:适宜叶状体发生的培养基为6,7-V+IAA 0.5 mg/L,诱导率达50%;叶状体增殖的最佳培养基是无激素的MS(其中蔗糖用量20 g/L),叶状体继代培养55 d,其相对增殖率达1362.6%(即收获量是接种量的14.6倍)。通过薄层层析(TLC)和高效液相(HPLC)法检测叶状体提取物中的目标成分,表明本研究建立的叶状体具有累积与原植物相同的有效成分石杉碱甲的能力。     

液体培养的蛇足石杉离体叶状体生产石杉碱甲和生化特征研究

为了解浅层液体培养对蛇足石杉[Huperzia serrate (Thunb.) Trev.]叶状体的影响,采用不同用量培养液进行培养,对叶状体的生长、石杉碱甲(HupA)积累、抗氧化酶活性和内源激素的变化进行了研究。结果表明,培养液用量不同,叶状体产生的HupA含量有显著差异,15 mL浅层培养的HupA生产率可达3 115.159μg L–1,是对照的2.20倍。浅层液体培养的叶状体的超氧化物歧化酶活性始终高于对照,过氧化物酶活性在培养前期比对照提高,过氧化氢酶活性在培养后期比对照提高;内源激素IAA与GA含量低于对照,而ABA含量高于对照。因此,浅层液体培养的蛇足石杉离体叶状体生产HupA的能力更高,且HupA含量与内源激素ABA水平相关,叶状体生长期的3种抗氧化酶活性具有协作增强抗氧化作用。     

蛇足石杉原叶体的培养及孢子体的诱导

以蛇足石杉孢子囊为材料培养得到蛇足石杉原叶体,进一步对原叶体进行增殖培养并诱导产生蛇足石杉孢子体。结果表明,适合蛇足石杉原叶体增殖的培养基是无激素的MS培养基,在该培养基上培养60d,原叶体的增殖倍数达到131．1;较高浓度的外源激素对原叶体的增殖有抑制作用,而低浓度的外源激素对原叶体的增殖影响不大;原叶体在无激素培养基上培养90d,孢子体的诱导频率为4．0％;通过HPLC检测蛇足石杉原叶体中石杉碱甲的含量为0．0059％,是野生孢子体中含量的0．25倍。     

湘西蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量的测定

采用超声萃取法提取湘西蛇足石杉总生物碱,用高效液相色谱法同时测定其石杉碱甲、乙和丙含量,并分析其在植株不同部位的分布。结果表明:湘西4个样地蛇足石杉中石杉碱甲、乙和丙含量基本一致,分别达到0.5‰、0.3‰和0.04‰;但植株不同部位三种石杉碱含量差异显著,其中石杉碱甲和乙的分布均为叶>茎>根,石杉碱丙则是根大于叶和茎。由此可知,湘西蛇足石杉具有资源优势,石杉碱在植株的分布具有明显的部位选择性;采用HPLC可同时检测石杉碱甲、乙和丙,方法简单快速、准确可靠。     

H2O2预处理胜利褐煤镜质组的生物产气研究

【目的】研究H₂O₂处理对煤中镜质组生物产气的影响。【方法】选择内蒙古胜利褐煤作为研究对象,以实验室前期富集保存的产甲烷微生物作为出发菌群,首先通过浮选对煤炭进行显微组分分离(高镜质组GJ、中镜质组ZJ和低镜质组DJ),并对煤的物化性质进行表征,然后在固液比1:15、H₂O₂浓度10%、预处理时间30 d条件下用H₂O₂处理不同镜质组含量的样品,再以处理前后的原煤及残煤进行生物产气实验。采用气相色谱、X射线衍射和傅里叶变换红外光谱等方法分析H₂O₂处理前后产气及煤的物化性质变化。【结果】经过H₂O₂预处理后,煤中镜质组的含量有所下降,挥发成分增加,固定碳减少,H₂O₂与高镜质组煤样反应更剧烈,氧含量增加,碳含量减少。未经过处理的煤在100 d时产甲烷量为GJ＞ZJ＞DJ,分别为174.24、164.31、135.52 μmol/g煤,而经过H₂O₂预处理的煤在20 d后停止产气,最终产甲烷量分别为39.63、39.61、41.55μmol/g煤,比原煤产气减少了77.26%、75.89%和69.34%。随着镜质组含量的增加,经过H₂O₂处理后的煤样芳香环层片的层间距d₀₀₂、单层层片的延展度L_a和层片的堆叠度L_c减小,而芳香层数N增加,表明晶核结构变小。经过H₂O₂处理后煤芳烃碳、芳香族、C=O基团和C=C基团所占比例增加,芳环缩合度增大,含氧官能团变多。【结论】利用H₂O₂长时间处理使煤基质中较易被微生物利用的有机质结构减少,从而降低了产气能力。     

外源H2O2对盐碱胁迫下苹果矮化砧木幼苗生理特性的影响

以2年生苹果矮化砧木M9 T337为试材,采用盆栽试验法,设置浇灌清水(CK)和盐碱胁迫(0.1 mol/L NaCl+NaHCO₃溶液)+ 喷施5种浓度的H₂O₂ ［0(T₁)、0.2 mmol/L(T₂)、0.4 mmol/L(T₃)、0.6 mmol/L(T₄)、0.8 mmol/L(T₅)］ 处理,测定各处理叶片叶绿素含量、光合气体交换参数、渗透调节物质含量、抗氧化酶活性和细胞膜透性,并利用相关性与主成分分析进行综合评价,以探讨外源过氧化氢(H₂O₂)增强其盐碱耐性的生理机制。结果表明：(1)随着盐碱胁迫(T₁)的时间延长,M9 T337幼苗叶片叶绿素a(Chl a)含量、叶绿素b (Chl b)含量、叶绿素总量(Chl t)、净光合速率(P_n)、气孔导度(G_s)、蒸腾速率(T_r)、可溶性蛋白(SP)含量均呈逐渐下降趋势;胞间CO₂浓度(C_i)、可溶性总糖(TSS)含量、脯氨酸(Pro)含量、过氧化氢酶(CAT)活性、抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性、相对电导率(REC)、丙二醛(MDA)含量均呈上升趋势;超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化物酶(POD)活性均呈先升后降趋势。(2)与CK相比,盐碱胁迫+外源H₂O₂(T₂- T₅)处理后M9 T337幼苗叶片各指标均呈现不同幅度变化,且存在明显浓度效应,并以T₃(0.4 mmol/L H₂O₂)处理叶片的Chl a、Chl b、Chl t、SP和G_s降幅最小,C_i、REC、MDA升幅最小,TSS、Pro、APX升幅最大。(3)M9 T337幼苗叶片P_n与T_r、G_s、Chl a、Chl b、Chl t、SP、SOD、POD呈显著正相关,与C_i、MDA、CAT、APX、REC呈显著负相关。(4)综合评价表明,各处理对M9 T337幼苗叶片生理特性的效应依次为：CK>T₃>T₄>T₂>T₅>T₁。研究发现,叶面喷施适宜浓度H₂O₂可有效改善盐碱胁迫下M9 T337幼苗光合能力,显著提高抗氧化酶活性和渗透调节物质的含量,降低细胞膜透性,从而达到缓解盐碱胁迫的作用,并以0.4 mmol/L H₂O₂处理效果最佳。     

NO和H2O2诱导大豆根尖和边缘细胞耐铝反应的作用

 NO和H₂O₂是参与植物抗非生物胁迫反应的重要信号分子, 为了确定NO和H₂O₂在大豆(Glycine max)根尖和根边缘细胞(root border cells, RBCs)耐铝反应中的作用及其相互关系, 以‘浙春3号’大豆为材料, 研究了铝毒胁迫下大豆根尖内源NO和H₂O₂的变化, 以及外源NO和H₂O₂诱导大豆根尖和RBCs的耐铝反应。结果表明, 50 μmol·L^–1 Al处理48 h显著抑制大豆根的伸长, 提高Al在根尖的积累, 同时显著增加根尖内源NO和H₂O₂含量。施加0.25 mmol·L^–1外源NO供体亚硝基铁氰化钠(Na₂[Fe(CN)₅NO]·2H₂O, sodium nitroprusside, SNP)和0.1 mmol·L^–1H₂O₂, 能有效地缓解Al对大豆根伸长的抑制、根尖Al积累和RBCs 的死亡, 该缓解作用可以被0.05 mmol·L^–1 NO清除剂2-(4- 羧基苯)-4,4,5,5- 四甲基咪唑-1- 氧-3- 氧化物, 钾盐(C₁₄H₁₆N₂O₄·K, carboxy-PTIO, cPTIO)和150 U·mL^–1 H₂O₂清除酶(catalase, CAT)逆转。并且外源NO能够显著促进根尖H₂O₂的积累, 而外源H₂O₂对根尖NO的含量无显著影响。这表明NO和H₂O₂是诱导大豆根尖及RBCs耐铝反应的两种信号分子, NO可能通过调控H₂O₂的形成, 进而诱导大豆根尖及RBCs的耐铝反应。     

蛇足石杉产石杉碱甲内生真菌的分离鉴定

从9月份采集的野生药用植物蛇足石杉(Huperzia serrata)的茎、叶中分离纯化得到15株内生真菌,将上述内生真菌进行液体培养后,通过薄层层析法(TLC)和高效液相法(HPLC)对其代谢产物进行检测,结果表明菌株WX13产石杉碱甲(Huperzine A,HupA)。运用形态和培养特性观察,初步确定菌株WX13属于镰刀菌属(Fu-sarium sp.)。     

胞外ATP对AlCl3诱导的细胞死亡过程中胞内H2O2和Ca2+水平的影响及其生理机制分析

该实验以烟草悬浮细胞 BY 2 为材料,在烟草悬浮细胞中分别加入0.05、0.10、0.15、0.20 mmol·L^-1AlCl₃,以等体积去离子水处理的悬浮细胞液为对照,并依据前述实验结果选择0.15 mmol·L^-1 AlCl₃,分别添加5 mmol·L^-1 DMTU(H₂O₂ 抑制剂)、20 μmol·L^-1CaCl₂、15 μmol·L^-1 LaCl₃(Ca²⁺通道抑制剂)和50 μmol·L^-1 ATP设计多项处理,分析胞外ATP(eATP)对铝离子(Al³⁺)胁迫引起的植物细胞死亡及其胞内H₂O₂、Ca²⁺的影响,以揭示Al³⁺胁迫下植物调节细胞死亡的可能机制,进一步扩展对eATP功能的认知。结果显示：(1)随着 AlCl₃ 胁迫浓度的提高,细胞死亡水平和胞内H₂O₂水平上升,而胞内Ca²⁺和eATP水平则逐渐降低。(2)外援施加H₂O₂抑制剂 DMTU(二甲基硫脲)和Ca²⁺能够有效缓解AlCl₃诱导的细胞死亡水平的上升;而Ca²⁺通道抑制剂LaCl₃(三氯化镧)则加剧了AlCl₃胁迫下的细胞死亡。(3)在AlCl₃胁迫下对细胞添加外源ATP,能够缓解AlCl₃胁迫下胞内H₂O₂水平上升和Ca²⁺水平下降的同时,并显著降低AlCl₃胁迫导致的细胞死亡。研究表明, Al³⁺以剂量依赖的模式提升细胞死亡和细胞内H₂O₂的水平并降低胞内Ca²⁺和eATP水平,AlCl₃诱导的细胞死亡受到H₂O₂和Ca²⁺水平变化的调节,eATP可以通过调节H₂O₂与Ca²⁺水平缓解AlCl₃诱导的细胞死亡。推测Al³⁺胁迫可能通过抑制钙离子通道而破坏了细胞内H₂O₂和Ca²⁺之间的协同关系,外源ATP对Al³⁺诱导H₂O₂上升的缓解作用可能是由于其提升了细胞的抗氧化能力。     

蛇足石杉产石杉碱甲内生真菌SNZ-12的分离及鉴定北大核心CSCD

为了获取具有应用价值的产石杉碱甲内生菌,本文从蛇足石杉分离得到60株内生真菌,采用高效液相色谱法和质谱法分别检测各个真菌的提取物,发现内生真菌SNZ-12的提取物具有与石杉碱甲标品相近的色谱特征峰和保留时间(8. 994 min)以及相同的质谱特征峰((M+H)+=243. 1),说明内生真菌SNZ-12可以产石杉碱甲,其石杉碱甲产量约为1. 01 mg/L;并通过结合内生真菌SNZ-12的形态特征和18S r DNA序列分析,将其鉴定为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)。本文结果为利用微生物发酵生产石杉碱甲研究提供了潜在的菌种资源。     

蛇足石杉内生细菌多样性北大核心CSCD

【目的】探索国家二级保护野生药用植物蛇足石杉内生细菌的物种和生理活性多样性,发现并收集药用植物内生菌资源。【方法】分别从四川和福建等不同生态环境采集蛇足石杉植株,运用纯培养手段,对经过表面消毒处理的蛇足石杉样品进行内生菌的分离、培养;根据菌株16S r RNA基因信息,计算从蛇足石杉不同区系分离获得的内生细菌间的Jaccard指数、多样性指数、优势度指数与均匀度指数等,分析内生菌物种多样性;应用6种筛选模型对分离得到的内生菌进行生理活性测定,初步评价蛇足石杉内生细菌的生理活性多样性和药用价值。【结果】从12份蛇足石杉植物样品中分离获得356株内生菌菌株,菌株16S r RNA基因序列信息显示,分离得到的蛇足石杉内生细菌隶属于放线菌门、厚壁菌门和变形菌门等3个门的26个科、41个属,来源于蛇足石杉地上和地下部位的菌株数目、多样性指数等无明显差异。从中发现了分属于拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、Angustibacter、节杆菌属(Arthrobacter)、短小杆菌属(Curtobacterium)、Frondihabitans、Glaciihabitans、Jatrophihabitans、Luteimicrobium、Massilia、Naumannella和Tardiphaga等11个属的11个潜在新物种,以及皮生球菌科(Dermacoccaceae)的1个新属。在抗菌活性筛选中,356株纯培养物抗粪肠球菌、抗肺炎克雷伯菌、抗耻垢分枝杆菌以及抗水稻白叶枯病菌的阳性率分别是9.0%、1.4%、2.2%、0.8%;抑制SS04生长的降血脂药物筛选模型上的阳性率是8.1%;抗HIV-1的初筛阳性率为4.5%。共计74株菌在一个或多个筛选模型中显示出活性,初筛总阳性率为20.8%。【结论】蛇足石杉内生细菌具有丰富的物种多样性和生理活性多样性,是进一步发掘新型天然产物的理想菌种资源。     

基于组合模型预测蛇足石杉在中国的适生区北大核心CSCD

蛇足石杉是国家二级重点保护野生植物,目前面临生物资源骤减的威胁。该研究基于蛇足石杉在中国的分布数据和气候数据构建组合模型,预测蛇足石杉当前和未来(2070)气候情景下在中国的适生区,通过ERDAS和ArcGIS计算适生区面积及质心变化,探究气候变化对蛇足石杉适生区的影响,为蛇足石杉的保护提供理论依据。结果显示:(1)组合模型AUC值大于0.9,预测结果极好。(2)影响蛇足石杉适生区的主要生物气候变量是最湿月降水量、温度季节性、最冷季均温和最暖月最高温。(3)蛇足石杉当前总适生面积226.99×10^(4) km^(2),中、高适生区面积154.51×10^(4) km^(2),质心均位于湖南省西部。(4)蛇足石杉未来总适生面积变化不大,中、高适生区面积剧烈收缩,在RCP2.6、RCP4.5、RCP6.0及RCP8.5情景下分别净收缩14.34%、23.31%、31.63%和47.08%,总适生区质心和中、高适生区质心均向西北方向转移。研究表明,蛇足石杉中、高适生区受气候变化影响很大,未来随着排放水平升高将逐渐转变为低适生区和非适生区。     

Oligochitosan induced Brassica napus L. production of NO and H2O2 and their physiological function

NO (nitric oxide) and H₂O₂ (hydrogen peroxide) are important signaling molecule in plants. Brassica napus L. was used to understand oligochitosan inducing production of NO (nitric oxide) and H₂O₂ (hydrogen peroxide) and their physiological function. The result showed that the production of NO and H₂O₂ in epidermal cells of B. napus L. was induced with oligochitosan by fluorescence microscope. And it was proved that there was an interaction between NO and H₂O₂ with L-NAME (N^G-nitro-l-arg-methyl eater), which is an inhibitor of NOS (NO synthase) in mammalian cells that also inhibits plant NO synthesis, and CAT (catalase), which is an important H₂O₂ scavenger, respectively. It was found that NO and H₂O₂ induced by oligochitosan took part in inducing reduction in stomatal aperture and LEA protein gene expression of leaves of B. napus L. All these results showed that oligochitosan have potential activities of improving resistance to water stress.     

Study on the heterogeneous degradation of chitosan with H2O2 catalyzed by a new supermolecular assembly crystal: [C6H8N2]6H3[PW12O40]·2H2O

A new supermolecular assembly crystal, [C₆H₈N₂]₆H₃[PW₁₂O₄₀]·2H₂O (DMB-PWA), was synthesized with phosphotungstic acid (PWA) and 1,2-diaminobenzene (DMB) under hydrothermal conditions and was characterized by Fourier-transform infrared spectra (FTIR) and single-crystal X-ray diffraction analysis. DMB-PWA could effectively catalyze oxidative degradation of chitosan with H₂O₂ in the heterogeneous phase. The optimum degradation conditions were determined by orthogonal tests as follows: amount of chitosan 1.00 g, 30% (wt %); H₂O₂, 3.0 mL; dosage of catalyst, 0.06 g; reaction temperature, 85 °C; and reaction time, 30 min. The water-soluble chitosan with a viscosity-average molecular weight (M_v) of 4900 was obtained under the optimum degradation conditions and was characterized by FTIR, ultraviolet-visible diffuse reflection spectra (UV-vis DRS), and X-ray powder diffraction analysis.     

MeJA诱导的拟南芥保卫细胞H2O2积累与质膜H+-ATPase的关系

茉莉酸类物质(JAs)作为与昆虫啃噬及损伤相关的植物激素和信号分子在植物防御反应中起重要作用,但是茉莉酸引起的早期防御反应的机理仍不清楚。该研究以拟南芥叶片保卫细胞为材料,结合非损伤微测(NMT)及激光共聚焦技术探讨了茉莉酸诱导的保卫细胞中质膜H+-ATPase与H2O2积累的调控关系。结果表明:茉莉酸甲酯(MeJA)处理导致H+迅速跨膜外排和H2O2积累,H+外排和H2O2积累能够被钒酸钠抑制,而二苯基碘(DPI)处理则对MeJA诱导的H+跨膜外排无显著影响。研究结果证明,在MeJA诱导的早期信号事件中,质膜H+-ATPase的激活先于H2O2的产生。     

H2O2和ABA对干旱高温复合胁迫诱导的玉米叶片sHSPs表达的影响

以玉米脱落酸(ABA)缺失突变体vp5及其野生型Vp5的叶片为材料,分别采用ABA、碘化钾(H2O2清除剂)、钨酸钠(ABA抑制剂)预先处理,对干旱+高温复合胁迫下玉米叶片小热休克蛋白(sHSPs)基因表达进行研究,以确定H2O2和ABA对干旱+高温复合胁迫诱导的玉米叶片sHSPs基因表达的影响。结果显示:(1)与对照和干旱相比,高温、干旱+高温复合胁迫显著诱导了sHSP16.9、sHSP17.2、sHSP17.4、sHSP17.5、sHSP22和sHSP26等6种sHSPs的表达。(2)H2O2清除剂KI和ABA抑制剂钨酸钠预处理,仅略微抑制高温、干旱+高温复合胁迫诱导的6种sHSPs表达。(3)与未用100μmol/L ABA预处理的vp5相比,100μmol/L ABA预处理仅略微提高了高温、干旱+高温复合胁迫诱导的6种sHSPs的表达水平。研究表明,在干旱+高温复合胁迫条件下H2O2和ABA参与了干旱+高温复合胁迫诱导的玉米叶片sHSPs表达,但并无显著影响,暗示了H2O2和ABA不是干旱+高温复合胁迫诱导sHSPs表达的重要调控因子。     

Activation of cyclooxygenases by H2O2and t-butylhydroperoxide in aged rat lung

The arachidonate cascade is important for the generation of reactive species (RS), and cyclooxygenase (COX) is a key enzyme of this cascade. Tissues of 24-month-old rat lung showed a 2-fold increase in RS, malondialdehyde and thromboxane B₂ than those of 6-month-old rat. We found that the effects of 50 µM H₂O₂ and 200 µM t-butylhydroperoxide (t-BHP) specify on COX activity, and that their effects increased cytosolic COX activity in a concentration-dependent manner (1–50 µM) in 24-month-old rat. Our results suggested that COX activators such as t-BHP and H₂O₂, which are located in cytosol, are essential for the activation of COX in aged lung.     

Quercetin-induced H2O2 mediates the pathogen resistance against Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Quercetin is a potent antioxidant and has been extensively used as a therapy intervention to prevent age-associated diseases. However, emerging studies showed it can also act as a prooxidant and induce H₂O₂ under certain conditions. In the current study, our results showed that quercetin contributed to the pathogen resistance in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) in response to the infection of virulent strain Pseudomonas syringae pv. Tomato DC3000 (Pst). Various defense responses, such as H₂O₂ burst, callose deposition, cell death, PR1 (pathogenesis-related 1) and PAL1 (Phe ammonia-lyase 1) gene expression, have been investigated in quercetin-pretreated Pst-inoculated Arabidopsis Col-0 and there was a strong defensive response in quercetin-pretreated Arabidopsis against virulent Pst. However, with the presence of catalase, the protective effects of quercetin on pathogen resistance to virulent Pst disappeared in Arabidopsis, suggesting that H₂O₂ may play a key role in plant defense responses. In addition, we confirmed that quercetin did not show any beneficial effect on pathogen-free leaves in Arabidopsis, indicating that pathogen challenge is also required to induce the defense responses in quercetin-pretreated Arabidopsis. Furthermore, strong defense responses have been observed in quercetin-pretreated Arabidopsis mutant jar1, ein2, and abi1-2 under Pst challenge, whereas no protective effect has been observed in quercetin-pretreated Arabidopsis mutant NahG and npr1. These findings indicate that quercetin induces the resistance to Pst in Arabidopsis via H₂O₂ burst and involvement of SA and NPR1.