重组人MBD4蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

为获得重组人MBD4蛋白,将编码MBD4的开放式阅读框（ORF）插入原核表达载体pGEX6P1 GST基因下游的多克隆位点（MCS）.将获得的表达质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3) 菌株扩大培养并用IPTG诱导融合蛋白的表达.用谷胱甘肽琼脂糖凝胶 4B亲和介质从菌体裂解液中纯化了GST-MBD4融合蛋白.经过Prescision protease专一性裂解成功去除了融合蛋白上的GST标签.通过Mono Q阴离子交换层析获得了纯度达94%以上的MBD4蛋白,该蛋白具有甲基化DNA结合和糖苷酶生物活性.     

小麦MBD基因家族的鉴定和特征分析

MBD蛋白是一类与甲基化DNA结合的反式作用因子,在植物生长发育调控过程中发挥重要功能。该研究以‘中国春’小麦为材料,利用生物信息学方法分析了小麦基因组中MBD基因家族成员的组成、序列特征、染色体定位和表达模式,利用qRT-PCR技术分析TaMBD6和TaMBD9基因的时空表达模式。结果显示:(1)小麦MBD基因家族包含16个成员(44个基因位点)分布于第1、2、5、6和7号染色体群;聚类分析表明,小麦MBD蛋白分别属于第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ和Ⅷ亚类,其中第Ⅱ、Ⅲ和Ⅷ亚类的MBD蛋白含有5个识别甲基化DNA的保守位点;基因结构分析显示,小麦MBD基因家族成员的内含子数目在1～10之间,启动子区域普遍存在光响应和激素应答元件,且基因组结构特征在同一亚类内高度相似。(2)RNA-Seq数据的基因表达谱分析显示,小麦MBD基因家族多数成员在穗和籽粒发育早期均有较高的表达水平,而且部分成员对干旱和热胁迫有明显响应。(3)qRT-PCR分析显示,TaMBD6和TaMBD9的3个部分同源基因在不同组织间差异表达,但均在幼穗中表达量最高。结果表明,小麦MBD基因可能在小麦发育及非生物胁迫响应过程中发挥调控功能,为进一步探讨小麦MBD基因的功能奠定了基础。     

小麦TaMBD4基因的克隆、结构及表达的初步分析

以拟南芥MBD基因的EST为基础,采用电子克隆并结合RT-PCR方法分离克隆了包含开放阅读框的小麦甲基结合域蛋白基因TaMBD4。序列分析显示,TaMBD4蛋白有典型的甲基结合域。组织表达特性分析表明,TaMBD4在干种子和胚乳中的表达量高于其它组织。TaMBD4的cDNA和基因组DNA比较分析显示,此基因包括1个内含子,进一步分析表明这个内含子为2个GGCAGT序列的串联重复,推测该内含子可能与TaMBD4基因的转录后调控相关。     

MBD3调节干细胞多能性和重编程机制的研究进展

MBD3(methyl CpG binding domain 3)是甲基CpG结合域蛋白家族的成员之一,也是NuRD(nucleosome remodeling and deacetylase complex)的核心亚单位之一。MBD3蛋白可以结合非甲基化DNA,通过MBD蛋白结构域或与NuRD结合发挥作用。MBD3通过参与调节染色质结构和激活转录过程,调节胚胎干细胞的多能性和谱系分化,对于胚胎发育和分化十分关键。MBD3在体细胞和神经干细胞重编程中也发挥着重要作用。此外,在缺氧环境下MBD3还能影响细胞代谢调控。该文围绕MBD3诱导DNA去甲基化、调节染色质结构、调控转录、调节胚胎干细胞的多能性和谱系分化、在重编程中的作用以及缺氧环境中的对细胞代谢的影响等展开论述,以期为多能干细胞的表观遗传研究及重编程技术的优化提供参考。     

牛组织中MBD1基因表达及其DNA甲基化调节

DNA甲基化是主要的表观遗传调节方式,在转录水平调节基因的表达,甲基化CpG结合蛋白MBD1能够结合甲基化及非甲基化的DNA,通过抑制域抑制基因的转录,在DNA甲基化和转录抑制之间起重要作用,但DNA甲基化对MBD1自身的调节作用还不清楚.本研究首先利用RT-PCR检测成年牛心脏、肾脏、肝脏、睾丸及卵巢5种组织中MBD1基因mRNA的表达;并根据牛MBD1调节区序列,针对其中的12个CpG位点设计引物,利用甲基化PCR测序分析方法,分析该调节区的DNA甲基化状态在牛5种组织中的变化.结果表明,在牛的5种组织中,MBD1基因在心脏和肾脏的表达量低于肝脏、睾丸及卵巢,且差异显著(P＜0.05);DNA甲基化检测显示,心脏和肾脏MBD1调节区的甲基化比率较肝脏、睾丸及卵巢甲基化低,说明调控区DNA甲基化与MBD1基因的组织特异性表达相关.     

MBD4/MED1的结构与功能

含甲基化CpG结合域蛋白质4(methyl-CpG-binding domain protein 4,MBD4)是MBD核蛋白家族中的一员,它包含一个能特异结合甲基化CpG的MBD结构域和一个具有糖苷酶活性的DNA糖苷酶结构域。该蛋白质能特异地结合甲基化CpG岛,并且在DNA错配修复、抑制转录和调节凋亡等过程中发挥重要功能,并与微卫星不稳定性密切相关。MBD4是一个重要的DNA损伤修复蛋白,多方面的报道表明其许多功能都牵涉到细胞衰老。本文就其结构与功能的研究进展作一综述。     

甲基化CpG结合域蛋白MBD2对胰腺癌细胞增殖和迁移的影响

该文探讨甲基化Cp G结合域蛋白2(methyl-Cp G-binding domain protein 2,MBD2)对人胰腺癌细胞增殖和迁移的影响。将干扰质粒MBD2 sh RNA转染入MBD2高表达的Pa Tu8988细胞和SW1990细胞中,运用CCK-8法检测细胞的增殖活性并绘制生长曲线,克隆形成实验检测细胞克隆形成率,Transwell检测细胞迁移率。结果显示,下调MBD2后,Pa Tu8988细胞中MBD2基因的表达量明显降低,细胞增殖减慢,克隆形成率降低,细胞迁移率减少;在SW1990细胞中下调MBD2基因后,得到类似结果。由此说明,沉默MBD2基因可以抑制胰腺癌细胞Pa Tu8988和SW1990的增殖和迁移,为进一步研究MBD2在胰腺癌细胞增殖与迁移中的作用机制奠定了基础。     

DNA甲基化在中枢神经系统发育中的研究进展

DNA甲基化是最早被发现的表观遗传修饰之一。近年来,大量的研究显示DNA甲基化在中枢神经系统(CNS)发育中发挥了重要作用。不同种类的DNA甲基转移酶(Dnmt)和DNA甲基结合蛋白(MBD)在CNS发育的不同阶段发挥不同的作用。DNA甲基化促进神经干细胞向神经元方向分化,抑制其向胶质细胞分化。Dnmt和MBD主要在神经元中表达,而在胶质细胞不表达或表达较少。DNA甲基化调节神经发生和突触的形成,参与学习记忆。星型胶质细胞的标志物GFAP去甲基化促进早期神经上皮分化为星型胶质细胞。少突胶质细胞相关基因MAG和Sox10等也受甲基化的调节。本文主要从以上方面综述了DNA甲基化在中枢神经系统发育中的作用。     

鉴定人甲基化CpG结合结构域蛋白4为蛋白激酶X的底物

人蛋白激酶X(PrKX)是由X染色体编码的一种cAMP依赖性蛋白激酶,但是到目前为止已鉴定到的PrKX底物还很少.为了鉴定蛋白激酶X的底物,我们以蛋白激酶X为诱饵进行了酵母双杂交实验,结果发现甲基化CpG结合结构域蛋白4(MBD4)与PrKX在酵母细胞内相互作用较强.GST融合蛋白沉降和细胞内蛋白质的免疫共沉淀证实PrKX与MBD4之间确实存在相互作用.进一步研究表明,大肠杆菌中表达的重组MBD4在体外可以被PrKX磷酸化,而且MBD4蛋白的磷酸化能明显增强它在体外与甲基化DNA探针的结合活性.     

棉花脱水应答元件(DRE)结合蛋白GhDBP1的原核表达、纯化及其DNA结合活性

棉花是一种重要的经济作物,其生产和产量要受到干旱、低温和高盐等环境胁迫的影响,因此提高棉花对这些胁迫的抗性非常重要.脱水应答元件(DRE-dehydrationresponsiveelement)结合蛋白(DBP)在调节植物对环境胁迫的抗性中起到非常重要的作用.而且过量表达DBP类基因的转基因植株能够很好抵抗这些环境胁迫,所以研究棉花中此类DRE元件结合蛋白对棉花生产有非常重要的意义.在以前的工作中,从棉花中分离一个DBP基因,命名为GhDBP1并在转录水平上分析它在棉花植株中的表达特征.在研究中,报道了GhDBP1的原核表达、纯化和它的DNA结合特性.GhDBP1基因的编码区用PCR技术扩增出来插入到原核表达载体pET28a中,并转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中.经过IPTG诱导,GhDBP1融合蛋白在BL21(DE3)菌株中成功进行表达.利用Ni-NTA亲和层析技术得到了纯化的融合蛋白.在非同位素的凝胶滞留实验中,纯化的GhDBP1融合蛋白能够结合到含有DRE元件的DNA片段上.另外,用SWISS-MODEL软件对GhDBP1蛋白的DNA结合区的三维结构进行了计算机模拟.模拟的结果显示,GhDBP1蛋白的DNA结合区的主链结构和折叠模式与已知的拟南芥GCC盒结合蛋白AtERF1的DNA结合区结构很相似.这些结果显示了GhDBP1是一个脱水应答元件(DRE)结合的转录因子,并可能运用与AtERF1的DNA结合区相似的结构和它的目标序列脱水应答元件(DRE)相结合.     

The Drosophila MBD2/3 protein mediates interactions between the MI-2 chromatin complex and CpT/A-methylated DNA

Methyl-DNA binding proteins play an important role in epigenetic gene regulation. The Drosophila genome encodes a single protein (MBD2/3) with extended homologies to the vertebrate methyl-DNA binding proteins MBD2 and MBD3. However, very little is known about its functional properties. We have now characterized an MBD2/3 null mutant allele that is viable and fertile. This mutation caused a strong dominant suppression of position-effect variegation and also resulted in a high rate of chromosome segregation defects during early embryogenesis. Confocal analysis of mutant embryos showed local displacement of MI-2 from DNA and indicated that MBD2/3 is associated with only a subset of MI-2 complexes. In addition, band shift experiments demonstrated a specific binding of MBD2/3 to CpT/A-methylated DNA, which reflects the endogenous DNA methylation pattern of Drosophila. Consistently, the localization of MBD2/3 was disrupted in embryos with reduced levels of DNA methylation. Our data provide novel insights into the function of MBD2/3 proteins and strongly suggest the existence of methylation-dependent chromatin structures in Drosophila.     

The mCpG-binding domain of human MBD3 does not bind to mCpG but interacts with NuRD/Mi2 components HDAC1 and MTA2

Although mammalian MBD3 contains the mCpG-binding domain (MBD) and is highly homologous with the authentic mCpG-binding protein MBD2, it was reported that the protein does not bind to mCpG specifically. Using recombinant human wild type and mutant MBD3 proteins, we demonstrated that atypical amino acids found in MBD3 MBD, namely, His-30 and Phe-34, are responsible for the inability of MBD3 to bind to mCpG. Interestingly, although H30K/F34Y MBD3 mutant protein binds to mCpG efficiently in vitro, it was not localized at the mCpG-rich pericentromeric regions in mouse cells. We also showed that Y34F MBD2b MBD, which possesses not the mCpG-specific DNA-binding activity but the nonspecific DNA-binding activity, was localized at the pericentromeric regions. These results suggested that the mCpG-specific DNA-binding activity is largely dispensable, and another factor(s) is required for the localization of MBD proteins in vivo. MBD3 was identified as a component of the NuRD/Mi2 complex that shows chromatin remodeling and histone deacetylase activities. We demonstrated that MBD3 MBD is necessary and sufficient for binding to HDAC1 and MTA2, two components of the NuRD/Mi2 complex. It was therefore suggested that mCpG-binding-defective MBD3 has evolutionarily conserved its MBD because of the secondary role played by the MBD in protein-protein interactions.     

Dissection of the methyl-CpG binding domain from the chromosomal protein MeCP2.

MeCP2 is a chromosomal protein which binds to DNA that is methylated at CpG. In situ immunofluorescence in mouse cells has shown that the protein is most concentrated in pericentromeric heterochromatin, suggesting that MeCP2 may play a role in the formation of inert chromatin. Here we have isolated a minimal methyl-CpG binding domain (MBD) from MeCP2. MBD is 85 amino acids in length, and binds exclusively to DNA that contains one or more symmetrically methylated CpGs. MBD has negligable non-specific affinity for DNA, confirming that non-specific and methyl-CpG specific binding domains of MeCP2 are distinct. In vitro footprinting indicates that MBD binding can protect a 12 nucleotide region surrounding a methyl-CpG pair, with an approximate dissociation constant of 10(-9) M.