响应面法优化Vc二步发酵新菌系产2-酮基-L-古龙酸的培养基

以短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)HJ-04作为维生素C二步发酵第2步中的伴生菌,促进产酸菌产维生素C(Vitamin C,Vc)前体2-酮基-L-古龙酸(2-keto-L-gulonic acid,2-KGA)的能力强于工业生产用菌株巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) B2980.采用单因素试验、Plackett-Burman(PB)试验及Box-Behnken试验对影响新菌系发酵产2-KGA的6个因素进行分析优化.结果表明,L-山梨糖、尿素、玉米浆为显著影响因子.最佳产酸条件为L-山梨糖94.95 g/L,尿素11.99 g/L,玉米浆14.13g/L.优化后产酸量提高12.31 mg/mL,产酸周期缩短6h.     

短小芽胞杆菌的益生作用及其生物降解功能

短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)是一种重要的微生物资源,能够分泌活性较强的代谢产物,在农业、工业、医药等领域具有良好的应用前景。就目前短小芽胞杆菌对动植物的抗菌、抗病毒、改善农作物品质等益生作用及其生物降解功能进行综述,总结并分析降解过程中可能存在的问题,为进一步研究短小芽胞杆菌的生物学功能及其在多个领域的应用提供参考。     

枯草芽胞杆菌B006产表面活性素的培养条件优化

芽胞杆菌产生的环脂肽类生物表面活性素surfactin具有重要抗菌、促进生物膜形成等功能,其含量和同系物组分构成影响其功能。为了提高芽胞杆菌B006产生表面活性素的产量,通过单因素实验和正交实验,测定了碳源、氮源和无机盐等营养物质及接种量、培养时间、装液量和初始pH值对芽胞杆菌B006摇瓶发酵产生表面活性素的影响;采用排油圈法测定发酵液中表面活性素的产量,采用HPLC-MS方法比较培养基优化前后surfactin的产量和组分含量。结果表明,适合芽胞杆菌B006摇瓶发酵产生表面活性素的培养基组成为:牛肉膏10 g/L、玉米粉15 g/L、硝酸铵3 g/L和氯化钠3 g/L;适合的培养条件为:初始pH值7.0、接种量10%、装液量60 m L/500 m L,发酵周期64 h。优化后surfactin的产量约为314.73 mg/L,比优化前提高了74.88%;surfactin各组分比例发生改变,其中C16和C17组分的含量明显提高,为优化前相应组分含量的1.64和8.34倍。优化的培养基组分和培养条件可明显提高芽胞杆菌B006菌株产生surfactin的产量,改变surfactin同系物组分的构成,为利用芽胞杆菌B006进行高活性表面活性素的工业生产和代谢调控研究奠定了基础。     

培养基组分对枯草芽胞杆菌产表面活性素的影响

表面活性素(surfactin)中的C15组分是表面活性素Surfactin异构体混合物中的重要活性组分,在表面活性、溶血活性、抗病毒活性和抑菌活性方面都有突出的表现。考察培养基p H、碳源、氮源、碳氮比、金属离子以及氨基酸等主要参数对枯草芽胞杆菌发酵产物surfactin中C15组分的影响,利用优化后的培养基(葡萄糖20 g/L、NH4NO32 g/L、K2HPO43 g/L、Na H2PO410 g/L、Mg SO40.02 g/L、Leu 1 g/L和p H 8.5),枯草芽胞杆菌BS-37发酵24 h,surfactin总产量达750 mg/L,其中C15组分达510 mg/L,占surfactin总量的68%。     

酸性半纤维素降解细菌的筛选与鉴定

从南方酸性水稻土和腐烂秸秆中采集样品,经初筛、复筛获得4株产生明显水解圈且D/d值较大同时传代效果稳定的酸性半纤维素降解细菌。DNS法测定4株细菌半纤维素酶活力,最终结合其产酶速度及酶活大小得到菌株NB8,液体摇瓶发酵72 h其半纤维素酶活达85.12 U/mL。经形态学观察和生理生化指标测定,初步确定该菌为芽胞杆菌属。结合16S rDNA基因序列分析结果,可以初步鉴定NB8为短小芽胞杆菌(Ba-cillus pumilus)。     

土壤中可编码乌头酸异构酶的芽胞杆菌菌株筛选及鉴定

【目的】以芽胞杆菌(Bacillus)为筛选对象,分离土壤中可编码乌头酸异构酶(aconitate isomerase,AI)的革兰氏阳性(Gram positive,G+)菌株,以丰富对AI分布的科学认识,为其生物学功能研究奠定理论与材料基础。【方法】采用土样高温预处理法、含反式乌头酸(trans-aconitic acid,TAA)唯一碳源的ACO固体平板培养法,结合16S rDNA基因序列同源性分析,筛选能够编码AI的芽胞杆菌目的菌株。【结果】共分离得到22株能够利用TAA碳源的细菌菌株,成功鉴定了其中的16株,分别为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) 2株,阿氏芽胞杆菌(Bacillus aryabhattai) 7株,短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus) 1株,未鉴定到种的芽胞杆菌(Bacillus sp.) 6株;且它们所含AI编码基因与已知AI基因在序列上存在差异。【结论】首次证明可编码AI的芽胞杆菌细菌种类具有多样性,暗示G+细菌广泛编码AI的可能性,更新了AI几乎只在G–细菌中分布的观点,为后续深入挖掘AI基因及其生物学功能研究提供更多可用微生物资源。     

响应面法优化短短芽胞杆菌ch2-22的发酵工艺

在摇瓶发酵条件下,优化提高短短芽胞杆菌ch2-22芽胞浓度和抑菌活性的发酵培养基和培养条件。首先在单因素试验基础上进行响应面设计对ch2-22的发酵培养基进行优化,然后使用单因素试验方法确定最佳发酵条件,得到优化发酵培养基为淀粉35.05 g/L,豆饼粉26.08 g/L,蔗糖10 g/L,鱼粉5 g/L,Na Cl 1 g/L,Mg SO40.3 g/L,(NH4)2SO43 g/L,Mn SO40.1 g/L,K2HPO43 g/L,酵母膏1 g/L,Ca CO32 g/L。培养条件为温度32℃,转速180 r/min,装液量100 m L/500 m L,接种量4%,初始pH为7.0,发酵时间45 h。优化后的芽胞数量达到8.1×109cfu/m L,与优化前的芽胞数量(1.6×109cfu/m L)相比,提高了3.7倍,优化后发酵液效价达到3 350 IU/m L,提高了109%,高于同类菌株的2 000 IU/m L。     

益生乳酸菌Lactobacillus casei Zhang和Lactobacillus plantarum P8对全价饲料pH及微生物类群变化的研究

研究了益生乳酸菌干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang)和植物乳杆菌P8(Lactobacillus planta-rum P8)对全价饲料pH及微生物类群变化的影响。分别将L.casei Zhang、L.plantarum P8单一菌种及复合菌种(11)以6.30 lg cfu/g的接种总量发酵全价饲料,测定25℃10 d发酵期间全价饲料pH和微生物类群的变化,应用选择培养基测定发酵饲料中的乳酸菌及杂菌(酵母菌、霉菌、大肠菌群、芽胞杆菌和梭状芽胞杆菌)的动态变化,应用RT-PCR技术测定试验组中的L.casei Zhang和L.plantarum P8的动态变化。结果显示,试验组pH下降显著,发酵10 d时,L.casei Zhang、L.plantarum P8单一菌种和复合菌种发酵饲料的pH分别为4.23、4.24和4.22,显著低于对照组(P0.05);L.casei Zhang、L.plantarum P8单一菌种和复合菌种发酵饲料中的L.casei Zhang、L.plantarum P8活菌数分别为8.91、8.89、6.58和8.69 lg cfu/g。发酵期间,试验组中酵母菌、霉菌、大肠菌群、芽胞杆菌及梭状芽胞杆菌活菌数显著低于对照组(P0.05),其中L.plantarum P8单一菌种发酵和复合菌种发酵对杂菌抑制效果显著优于L.casei Zhang单一菌种发酵(P0.05)。结果表明,全价饲料经L.casei Zhang、L.plantarum P8发酵可以显著降低其pH,抑制其中杂菌的生长,同时L.casei Zhang、L.plantarum P8在饲料中具有良好的稳定性。     

濒危植物盐桦离体组织培养特性的研究

目的:探讨新疆濒危植物盐桦离体组织培养的特性。方法:从盐桦原生地阿尔泰阿拉哈克盐湖边采摘盐桦休眠实生苗上的落叶枝条,待其萌发后分别取带芽嫩茎、嫩茎茎段及嫩叶芽尖三种不同材料接种于启动培养基,比较三种盐桦离体组织的诱导分化,继而设计不同激素、不同水平的单因子试验和正交试验,筛选适宜盐桦外植体芽增殖和生根的分化培养基。结果:诱导盐桦芽增殖的最佳外植体是带芽嫩茎,盐桦外植体增殖、壮苗最适培养基为:MS 6-BA 1.0mg/L IBA 0.5mg/L;盐桦外植体生根最适培养基为:1/2MS IBA 0.5mg/L 蔗糖30g/L 琼脂7% 暗光处理3d。结论:本研究筛选获得适宜盐桦芽增殖和生根的最佳培养条件,为高效扩繁和保存盐桦种质资源奠定了基础。     

三叶半夏种质资源扩繁及保存研究*

目的:通过对三叶半夏扩繁和保存方法的研究,为三叶半夏种质资源的保育和开发利用提供技术支撑。方法: 首先,通过灭菌条件筛选、愈伤诱导及丛生芽诱导等进行扩繁条件探索;其次,通过设置不同基本培养基、蔗糖浓度、不同温度和光照强度等条件探索合适的种质保存条件;最后,探索了休眠块茎唤醒方式和丛生芽再诱导方法,为种质资源再扩繁提供基础。结果: 以叶柄为外植体,升汞灭菌12 min后,接种至添加2,4-D的培养基中可诱导疏松愈伤组织。外植体接种至MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+蔗糖30 g/L +琼脂6.0 g/L,pH 5.8中可进行丛生芽诱导。合适的种质保存基本培养基为MS和N6培养基;合适的蔗糖浓度为30 g/L,过低或过高均不利于种质保存;在丛生块茎诱导时需要提供足够的温度和光照,低温及避光条件不利于种质保存。待丛生芽自然倒苗休眠后可进行长达1~2年的离体保存。对休眠块茎进行唤醒诱导时可采用切割块茎后再接种的方式。萌发出来的叶柄直接进行丛生芽诱导增殖,而块茎则接种至MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+琼脂6.5 g/L,pH 5.8中进行再分化诱导丛生芽。诱导出来的丛生芽进行规模化扩繁或继续进行离体保存。结论: 通过对三叶半夏的种质扩繁,筛选合适的条件得到休眠丛生块茎,可对三叶半夏进行长时间的离体保存,而后唤醒和再次诱导的相关研究,为其种质资源保存、利用提供技术基础。     

不同添加物对文心兰原球茎增殖及试管苗生长的影响

以文心兰切花品种‘南茜’原球茎(PLB)及试管苗为材料,在培养基MS＋6-BA 2 mg/L＋Ad 1 mg/L＋NAA 0.1 mg/L＋蔗糖30 g/L基础上,利用增殖系数及不同形态指标加权分析研究马铃薯、芋头、南瓜、香蕉及活性炭(AC)5种培养基添加物及其组合对‘南茜’PLB增殖及试管苗生长的影响。结果表明,适宜文心兰PLB增殖培养的添加物为马铃薯泥50 g/L,培养45 d后,PLB增殖系数是对照的3.64倍;适宜无菌小苗(约1.5 cm)增殖及生长的添加物为香蕉泥50 g/L＋AC 1 g/L,加权总分是对照的1.53 倍;适宜无菌中苗(约2.5 cm)增殖及生长的添加物为马铃薯泥25 g/L＋香蕉泥25 g/L,加权总分是对照的1.55倍。     

冬凌草组织培养及其愈伤组织诱导研究

实验采用L9（34）正交试验方法优化冬凌草组织培养快繁培养基,筛选冬凌草增殖、生根和愈伤组织诱导的最佳培养基配方。结果表明：不定芽诱导的最适培养基为MS＋0.2 mg/L IBA＋0.1 mg/L6-BA＋0.2 mg/L NAA;生根培养基为1/2 MS＋1 mg/L IBA＋1 g/L活性炭;以冬凌草茎段为外植体诱导愈伤最佳培养基为MS＋1.5 mg/L6-BA＋2 mg/L2,4-D。     

TGF-β_1对不同阶段哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖的作用

目的探讨TGF-β1对不同阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖的作用。方法建立2周、6周哮喘大鼠模型,分别以1μg/L、10μg/L和100μg/LTGF-β1干预ASMCs生长。采用流式细胞仪、MTT法检测ASMCs增殖情况,观察不同浓度TGF-β1对ASMCs增殖的影响。结果 2周和6周哮喘组ASMCs的S期比例、A值分别为（34.31±1.41）%、（35.96±3.46）%;（0.546±0.005）、（0.559±0.009）与对照组（12.24±2.64）%、（0.289±0.009）比较均显著增高（均P〈0.01）。2周、6周哮喘模型组的各TGF-β1干预组ASMCs的S期比例、A值与各自哮喘组比较均显著升高（均P〈0.01）,10μg/L和100μg/LTGF-β1组比1μg/LTGF-β1组对ASMCs增殖作用明显增加（P〈0.01）,10μg/LTGF-β1组和100μg/LTGF-β1组相比,ASMCs增殖细胞占细胞总数的百分比无明显变化,两种浓度增殖作用无有明显差别（P〉0.05）。而2周和6周哮喘组相比,加入不同浓度TGF-β1干预后的差别不大（P〉0.05）。结论与正常鼠相比,2周和6周哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖明显,处于S期的细胞比例明显增高,6周哮喘大鼠气道平滑肌较2周哮喘大鼠增殖更明显。经TGF-β1干预后,2周和6周哮喘哮喘大鼠气道平滑肌细胞处于S期的细胞比例增加,增殖增强,提示TGF-β1可能在哮喘早期阶段即可促进大鼠气道平滑肌细胞增殖,并促进各阶段哮喘大鼠气道平滑肌细胞持续增殖。     

TNF—α对哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖及ERK1／2活性的影响

目的探讨TNF—α对哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖及对ASMCs上ERK1／2mRNA、p-ERK1／2表达水平的影响。方法通过对哮喘模型大鼠ASMCs培养,分别以0．2μg／L、1．0μg/L、20μg/L TNF-α干预ASMCs生长。采用流式细胞仪、MTT法检测ASMCs增殖情况,观察不同浓度TNF—α对ASMCs增殖的影响。RT-PCR检测ASMCs上ERK1／2mRNA表达,免疫细胞化学染色法检测磷酸化ERK1／2蛋白的表达及定位。结果哮喘组ASMCsS期比例、A值、ERK1／2mRNA、p-ERK1／2蛋白的表达量分别为（34．45±2．08）％、（0．550±0．010）、（0．995±0．118）、（130．77±4．16）,与对照组（11．17±0．96）％、（0．292±0．008）、（0．576±0．098）、（163．82±1．38）比较均显著增高（均P〈0．01）。各TNF—α干预组ASMCs的S期比例、A值、ERK1／2mRNA和p-ERK1／2蛋白表达量与哮喘组比较均显著降低（均P〈0．01）,0．2μg/L和1．0μg／LTN-α组p-ERK1／2蛋白表达量高于对照组（P〈0．01）,20μg／L TNF-α组p-ERK1／2蛋白表达量与对照组比较无差异（P〉0．05）。结论与正常鼠相比,慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖明显,处于S期的细胞比例明显增高。经TNF—α干预后,慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞处于S期的细胞比例减少,增殖减弱,TNF-α可能抑制慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖。TNF—α可下调慢性哮喘大鼠气道平滑肌细胞上ERK1／2mRNA及p-ERK1／2表达,TNF-α可能通过抑制ERK信号转导通道的活性对气道平滑肌细胞的增殖进行调控。     

IL-19对哮喘模型大鼠气道平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨IL-19对哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMCs）增殖的作用。方法通过对大鼠进行雾化卵清蛋白,制备哮喘模型大鼠。提取哮喘大鼠ASMCs进行培养,分别以1μg/L、10μg/L、100μg/L IL-19干预ASMCs生长。采用流式细胞仪、MTT法检测ASMCs增殖情况,观察不同浓度IL-19对ASMCs增殖的影响。结果与正常鼠相比,慢性哮喘大鼠ASMCs增殖明显,处于S期的细胞比例明显增高。经10μg/L、100μg/L IL-19干预后,慢性哮喘大鼠ASMCs处于S期的细胞比例减少,增殖亦减弱。且两组间比较有明显差异。而经1μg/L IL-19干预后,慢性哮喘大鼠ASMCs处于S期的细胞比例及增殖均无明显变化。结论一定浓度的IL-19可能抑制慢性哮喘大鼠ASMCs的增殖。     

重组α-环糊精葡萄糖基转移酶表达条件的优化及其产物专一性的分析

将来源于Bacillus sp 602 -1的α-环糊精葡萄糖基转移酶(ot-CGT)基因(cgt)插入到表达载体PQE30中,构建重组质粒PQE30/cgt,成功转化宿主菌E coli M15后,得到重组菌株E coli M15 (PQE30/cgt).在IPTG的诱导下得到酶表达的最适条件:TB培养基,0.01 mmol/L IPTG,诱导温度16℃,胞内酶比活力最高可达5 209 U/mL;加入IPTG 24 h后,添加甘氨酸和甘露醇会促使酶向胞外分泌.酶蛋白自诱导表达的适宜条件为在TB培养基中添加乳糖3.0 g/L,葡萄糖1.2 g/L,16℃培养96 h,酶比活力达到8 635 U/mL,明显高于IPTG诱导的效果.通过SDSPAGE验证了上述结论.酶催化转化实验表明:重组酶转化质量分数为1％可溶淀粉24h后,α-环糊精(α-CD)转化率可达38.2％,α和β的峰面积比约为3.4:1,α-CD具有较高的专一性,因此该重组α-CGT酶具有较好的工业化应用前景.     

白凤菜扦插繁殖技术研究

为了探讨白凤菜扦插繁殖的适宜条件,采用不同基质、不同成熟度插条及不同萘乙酸（NAA）浓度三个因素进行三因素随机区组试验,萘乙酸、插条成熟度和基质组成对白凤菜插条生根数量均有显著影响,其中萘乙酸处理对白凤菜插条生根数量的影响最大,枝条成熟度其次,扦插基质影响较小,结果表明扦插生根的最佳组合为：1000mg／kgNAA×幼嫩枝条x泥炭土：珍珠岩=1：1,NAA极显著地促进插条生根,数量增多,同时又极显著地抑制根的伸长生长。     

胰高血糖素样肽1对脂多糖诱导的血管内皮细胞炎性反应的影响

目的：探讨胰高血糖素样肽1（glucagon like peptide 1,GLP-1）对脂多糖（1ipopolysaccharide,LPS）诱导的血管内皮细胞（VEC）炎性反应的影响。方法：以体外培养的人动脉VEC为研究模型,将细胞分为四组（对照组、LPS刺激组、LPS±GLP-1组、GLP-1组）,Rhodamin-Phalloidin检测肌动蛋白骨架F-actin分布,用苏木素-伊红（HE）染色观察细胞间连接的形态特征,用示踪剂Rhodamine Bisothiocyanate-Dextran检测VECs单层通透性变化改变,酶联免疫吸附实验检测细胞分泌白介素（IL）-6和IL-8的变化。结果：GLP-1（100nM）可减少LPS（1μg／mL）刺激后细胞肌动蛋白骨架F-actin应力纤维的形成,并抑制LPS刺激后细胞间连接的中断。Rhodamine B isothiocyanate-Dextran细胞通透性检测结果显示：GLP-1可明显降低LPS刺激引起的VEC通透性增加[由（2．57±0．19）×10^-5cm／s降至（2．10±0．18）×10^-5cm／s,P〈0．05]。此外,GLP-1可抑制LPS刺激后VEC中炎性细胞因子IL-6和IL-8的表达[分别由（42130±6522）pg／ml降至（27478±5096）pg／ml和（18376±1561）pg／ml降至（14414±927）pg／ml,均P〈0．05]。结论：GLP-1可对抗LPS刺激引起的VEC炎症反应和细胞通透性增加．改善LPS诱导的内皮细胞炎性损伤。     

种子培养基成分对裂殖壶菌发酵产DHA的影响

考察种子培养基中谷氨酸钠质量浓度和NaCl质量浓度（盐度）对Schizochytrium sp. HX-308菌种质量及发酵性能的影响。结果表明：40 g/L谷氨酸钠条件下培养菌种,发酵后DHA质量分数达到（53.25±0.48）%,而其油产量、油脂质量分数和DHA产量分别为（24.9±0.4）g/L、（45.2±0.6）%、（8.6±0.35）g/L; 利用不含谷氨酸钠的种子培养基发酵,其油产量、油脂质量分数和DHA产量分别为（30.1±0.8）g/L、（54.3±0.5）%、（12.1±0.5）g/L,比含40 g/L谷氨酸钠时分别提高了20.88%、20.13%和40.70%,为菌种驯化提供了新的思路和方向。此外,低盐度培养条件有利于菌种生产性能的发挥,6.25 g/L NaCl条件下发酵后油质量分数、DHA产量及DHA质量分数最高,分别为（62.1±0.8）%、（10.0±0.3）g/L、（48.97±0.42）%。     

连翘酯苷对小鼠脾脏淋巴细胞体外增殖与分泌功能的影响

目的分析连翘酯苷（FS）对小鼠脾脏T和B淋巴细胞增殖、分泌NO和TNF-α的影响,初步探讨其免疫调节作用机制。方法无菌操作分离小鼠脾脏,制备脾脏细胞并用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养,在培养液中分别加入刺激剂刀豆蛋白（ConA）和脂多糖（LPS）以及不同浓度40、80、160μg/mL的FS共培养不同时间,采用MTT法检测T和B淋巴细胞的吸光度变化,ELISA和Griess法分别检测细胞分泌TNF-α和NO的水平。结果低浓度和中浓度FS对ConA诱导T淋巴细胞24 h和48 h后细胞增殖和存活率明显提高,诱导时间延长至72 h后FS明显抑制细胞转化;低浓度FS对LPS诱导脾脏B淋巴细胞24 h后细胞增殖和生存率显著提高;FS促进小鼠脾脏T和B淋巴细胞分泌NO;FS促进B淋巴细胞分泌TNF-α,中浓度FS促进T淋巴细胞分泌TNF-α而高浓度反而抑制其分泌。此外,FS对环磷酰胺（CY）处理小鼠的脾脏淋巴细胞体外增殖有明显影响,对细胞NO分泌影响不显著。结论结果提示FS可能通过影响小淋巴细胞增殖和细胞因子分泌而调节免疫细胞功能。