新生期缺氧缺血脑白质损伤大鼠神经元树突和突触损伤

目的探讨新生大鼠缺氧缺血脑白质损伤后脑内神经元的变化。方法新生3日龄SD大鼠24只,随机分为对照组和缺氧缺血脑白质损伤(WMI)组。于缺氧缺血后4周,应用免疫荧光染色检测大鼠脑内髓鞘碱性蛋白(MBP)、皮层和海马神经核抗原(Neu N)、微管相关蛋白-2(MAP-2)和突触素(Syn)的表达,应用高尔基染色法观察神经元树突变化,并应用Western blot法进一步测定Syn表达量的变化。结果免疫荧光染色结果显示:与对照组相比,WMI组MBP表达减少,皮层和海马Neu N阳性细胞数未见明显改变,MAP-2阳性细胞突起弯曲、断续;高尔基染色结果显示:WMI组树突棘数量减少;免疫荧光染色和Western blot结果显示:WMI组Syn表达量降低。结论新生大鼠发生缺氧缺血脑白质损伤后树突损伤、树突棘数量减少、突触减少导致神经元之间联系减少,可能引起学习记忆能力减退。     

ALS转基因小鼠脊髓中miRNA-132表达减少BDNF表达增加

目的研究miRNA-132和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)在肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)转基因小鼠脊髓中的表达变化,探讨miRNA-132、BDNF在ALS发病中的作用。方法取SOD1-G93A ALS转基因鼠发病早期(95d)、中期(108d)和晚期(122d)脊髓组织,应用qRT-PCR及原位杂交(hybridization in situ, ISH)技术检测miRNA-132的表达及定位,应用qRT-PCR及Western blot技术检测BDNF在mRNA及蛋白水平变化,免疫荧光技术检测BDNF在脊髓中的表达及分布,以同窝野生型鼠作为对照。结果与野生型鼠比较,miRNA-132在ALS转基因鼠脊髓组织表达下降,miRNA-132阳性信号主要定位脊髓前角细胞胞体;在ALS转基因鼠脊髓组织BDNF mRNA及蛋白水平均增高,BDNF免疫阳性细胞主要表达于脊髓前角神经元,表达信号明显增强。结论 miRNA-132、BDNF可能在ALS发病过程中发挥了重要作用。     

ABRA在正常成年大鼠大脑皮质和海马区的表达

目的观察ABRA(Actin binding Rho activator)在成年大鼠大脑皮质和海马中的表达。方法制备成年大鼠脑的冰冻切片,采用共聚焦免疫荧光技术和免疫荧光强度测量检测ABRA在大鼠大脑皮质和海马区的表达。结果 ABRA在神经元的胞核、胞浆、突起内可见,其中胞核着色最强。在大脑皮质,ABRA阳性的神经元胞体和突起广泛分布于皮质的分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层、多形细胞层,其免疫荧光强度分别为129.22±16.94、125.39±29.83、117.67±22.50、105.85±17.65、103.90±18.00、100.23±20.38,ABRA阳性细胞率分别为0.51±0.01、0.69±0.02、0.64±0.03、0.58±0.05、0.65±0.09、0.63±0.01。在海马,ABRA均匀分布于海马各部,阳性神经元集中于锥体细胞层,而其阳性突起弥散分布于海马分子层和多形层。海马锥体细胞层、分子层、多形层免疫荧光强度分别为141.19±35.48、53.19±10.38、43.32±9.59,ABRA阳性细胞率分别为0.62±0.04、0.27±0.07、0.25±0.03。结论 ABRA广泛表达于大鼠大脑皮质和海马各层,提示ABRA可能在大鼠这些部位的神经细胞功能活动方面起重要作用。     

新生期缺氧缺血大鼠脑白质损伤及脑内Fyn、p-ERK和MBP下调

目的检测新生大鼠缺氧缺血后脑内酪氨酸蛋白激酶Fyn、p-ERK及髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)表达的变化,探讨Fyn-ERK通路在缺氧缺血脑白质损伤中的作用。方法新生3日龄SD大鼠24只,随机分为对照组和缺氧缺血(HI)组。缺氧缺血后4周,应用HE染色法观察脑组织病理学改变;应用免疫荧光染色法和Western blot法观察Fyn、p-ERK及MBP在大鼠脑内的定位定量表达变化。结果 HE染色显示缺氧缺血大鼠出现缺氧缺血脑白质损伤病理改变;免疫荧光染色和Western blot检测显示脑内Fyn、p-ERK和MBP水平均明显下调。结论新生期缺氧缺血损伤4周后,可能通过Fyn与p-ERK水平的下调而使MBP减少,进而使少突胶质细胞成熟障碍,引起脑白质损伤。     

波形蛋白在不同年龄大鼠脊髓后角表达

目的:检测波形蛋白(Vimentin)在不同年龄大鼠脊髓后角的表达,探讨Vimentin在大鼠脊髓成熟和衰老过程中的表达变化.方法:对新生(7天龄)、成年(2月龄)、老年(24月龄)大鼠脊髓进行Vimentin和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光双标染色,并进行荧光强度的定量分析.结果:新生组Vimentin阳性产物荧光强度(59.73±9.92)较强,成年组Vimentin阳性产物荧光强度(43.26±7.99)较新生组弱,老年组Vimentin阳性产物荧光强度(40.65±6.84)较成年组弱,两组间差异均有统计学意义(P＜0.01).结论:脊髓后角新生组、成年组、老年组Vimentin的表达随着年龄的增长而降低.     

肌萎缩侧索硬化症转基因小鼠脊髓中自噬相关基因ATG5表达降低

目的明确自噬相关基因ATG5在肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)转基因鼠脊髓中的表达情况.方法取95d、108d和122d ALS转基因小鼠和野生型小鼠脊髓,应用免疫荧光、Western blot和RT-PCR技术,检测ATG5在脊髓中的表达.结果免疫荧光染色检测显示,在脊髓内,ATG5免疫反应产物主要定位于神经元;与同窝野生型小鼠比较,脊髓内ATG5免疫反应性在95d转基因小鼠无明显差异,而在108d和122d转基因小鼠明显降低.Western blot和RT-PCR分析显示,与同窝野生型小鼠比较,脊髓内ATG5 mRNA和蛋白表达水平在95d无明显变化,但在108d和122d时,转基因小鼠脊髓内ATG5 mRNA和蛋白表达均显著低于同窝野生型小鼠.结论ATG5在ALS转基因鼠脊髓中表达降低,提示ATG5表达异常与ALS发生密切相关.     

亨廷顿蛋白相关蛋白1在成年大鼠脊髓中的分布

目的观察亨廷顿蛋白相关蛋白1(huntingtin-associated protein 1, HAP1)在成年大鼠脊髓中的分布特点.方法采用免疫组织化学ABC法和免疫印迹(Western blotting)方法.结果免疫组织化学结果显示,在成年大鼠脊髓中,以背角灰质浅层(Rexed Ⅰ,Ⅱ层)的HAP1免疫反应性最强,阳性细胞最密集,免疫反应产物除分布在胞体外,还大量弥散分布于胞体间的神经毡内;背角深层有部分HAP1免疫反应阳性细胞呈散在分布,中央管周围灰质(Rexed X)内阳性胞体密度和免疫反应性强度仅次于后角浅层,而在脊髓腹角,偶见HAP1免疫反应阳性神经元.此外, Western blotting分析显示,脊髓背角内HAP1表达水平明显高于脊髓前角.结论 HAP1主要分布于大鼠脊髓背角灰质浅层和中央管周围灰质神经元内,提示其可能与痛觉信息一级传入和/或调控有关.     

参乌胶囊及其有效成分二苯乙烯苷对老年大鼠脊髓腰节段细胞凋亡调节因子及p-CREB的影响

目的观察中药新复方参乌胶囊及其有效成分何首乌二苯乙烯苷对老年大鼠脊髓腰节段细胞凋亡及信号转导通路的影响。方法雄性SD大鼠,分为青年组（6月龄）、老年组（24月龄）、老年＋参乌胶囊小剂量（0.8 g/kg）、参乌胶囊大剂量（1.6 g/kg）、二苯乙烯苷小剂量（0.03 g/kg）、二苯乙烯苷大剂量（0.06 g/kg）组。应用Western blot方法检测大鼠脊髓腰节段Bax、Bcl-2及磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）的变化及药物的干预作用。结果与6月龄青年大鼠相比,24月龄老年大鼠脊髓腰节段凋亡促进因子Bax的表达增加,凋亡抑制因子Bcl-2的表达减少,神经元存活信号转导通路中p-CREB的表达降低。参乌胶囊和二苯乙烯苷分别灌胃给药3个月能够抑制老年大鼠脊髓腰节段内BAX的表达,增强Bcl-2表达。参乌胶囊还能够上调p-CREB表达。结论乌胶囊及二苯乙烯苷能够改善老年大鼠脊髓腰节段Bax、Bcl-2和p-CREB的变化,提示该药可能具有延缓脊髓衰老的作用。     

肝细胞生长因子在正常大鼠腰段脊髓和背根神经节的表达

目的:观察肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)在大鼠脊髓和背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)的表达。方法:取健康成年6只SD大鼠运用免疫组织化学染色技术检测HGF在腰段脊髓、背根神经节内的表达和分布。结果:在L4-6段脊髓,HGF免疫阳性产物可见于各板层神经元,尤以脊髓前角运动神经元明显;在DRG中,HGF免疫阳性物质可见于以大、中型为主的神经元的胞浆及突起中。结论:脊髓和背根神经节内的HGF通过与受体c-Met结合可能在神经再生及突触可塑性方面起一定作用。     

环氧合酶-1抑制剂对术后疼痛大鼠脊髓中ERK表达的影响

目的：探讨术前鞘内注射选择性环氧合酶-1（cyclooxygenase-1）抑制剂SC-560对术后疼痛大鼠机械痛觉超敏以及脊髓中磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表达的影响。方法：采用术后疼痛模型,于术后1h通过观察机械缩足反射阈值（MwT）测定术后痛觉超敏情况、免疫组化染色和免疫印迹检测脊髓中p-ERK表达的变化。结果：①术后疼痛大鼠术后1h出现明显痛觉超敏反应,术前鞘内注射SC-560 100μg可以明显抑制术后痛觉超敏;②术后1h大鼠腰段脊髓背角浅层p-ERK免疫组化染色阳性细胞数较正常对照组明显增加,鞘内注射SC-560可明显减少p-ERK阳性细胞数（P〈0．01）;术后1h大鼠腰段脊髓Western blot检测,p-ERK1／2蛋白的表达较正常大鼠均明显增加,鞘内注射9G560可以抑制p-ERK1／2蛋白的表达。结论：鞘内注射CO3X-1抑制剂可以抑制术后疼痛大鼠术后痛觉超敏反应,脊髓水平Ⅱ水可能介导其上述作用。     

猫腰髓中GABA能神经元的分布及年龄相关变化

目的观察和比较GABA能神经元在青年猫和老年猫L6段脊髓的分布,探讨GABA能神经元在脊髓中分布的年龄相关变化及意义.方法免疫组织化学ABC法.结果青年猫与老年猫L6段脊髓灰质内,GABA能神经元及神经纤维分布广泛,各个Rexed板层均可见GABA-IR细胞,其中背侧灰质阳性最强,其次是腹侧灰质.标记的GABA能神经元胞体为卵圆形、三角形、多角形和星形,可分为大、中、小三种类型.经比较,老年组GABA能神经元的数量及免疫反应性均明显低于青年组.结论老年动物脊髓调节功能的减弱可能与GABA能神经元减少有少.     

眼镜蛇毒对大鼠脊髓乙酰胆碱酯酶表达的影响

目的 探讨眼镜蛇毒对大鼠腰髓乙酰胆碱酯酶（AchE）表达的影响。方法 将蛇毒注射到大鼠左小腿下部,采用亚铁氰化铜法示AchE,观察大鼠腰髓前角AchE阳性神经元在眼镜蛇毒中毒组、生理盐水组、正常对照组的变化。结果 蛇毒组大鼠AchE阳性神经元比对照组表达增强。结论 眼镜蛇毒对腰髓的AchE阳性神经元表达有上调作用。     

脊髓水平nNOS和iNOS在吗啡戒断反应中的作用差异

目的:观察鞘内注射选择性一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抑制剂对吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断反应、脊髓Fos蛋白表达和脊髓神经元nNOS和iNOS表达的影响,以探讨nNOS和iNOS在吗啡依赖和戒断反应中的作用。方法:在大鼠吗啡依赖和戒断模型上,采用行为学、免疫组织化学和Western blot方法观察鞘内应用nNOS抑制剂7-硝基吲哚(7-Ni)和iNOS抑制剂氨基胍(AG)对吗啡依赖大鼠纳洛酮催促戒断反应、脊髓Fos蛋白表达和脊髓神经元nNOS和iNOS表达的影响。结果:①鞘内注射7-Ni、AG可明显减轻吗啡依赖大鼠戒断症状,戒断组戒断症状评分为28.6±4.89,7-Ni组为16.2±3.99(P<0.01),AG组为22.94±4.0(P<0.05);戒断组TEA评分为13.5±2.55,7-Ni、AG组分别为7.5±2.56、10.5±2.71(P<0.05);②鞘内注射7-Ni、AG可减少脊髓背角Fos阳性神经元的数目,7-Ni、AG组为228.2±49.5、296.8±50.6,低于戒断组(380±71,P<0.05);③7-Ni、AG组nNOS和iNOS阳性神经元的数目分别为169±32、10.2±2.85,均低于戒断组(239±45,16.8±5.1,P<0.05),两给药组脊髓NOS蛋白的表达也显著减少。结论:nNOS和iNOS抑制剂能减轻吗啡依赖及戒断大鼠的戒断症状和在脊髓水平抑制nNOS和iNOS的表达,nNOS起主要作用而iNOS可能起辅助作用。     

脊髓自噬功能激活与大鼠2型糖尿病神经病理性疼痛的关系

目的：探讨脊髓自噬功能与大鼠2型糖尿病神经病理性疼痛（DNP）的关系。方法：雄性SD大鼠（42只）高糖高脂饲养8周,腹腔单次注射链脲佐菌素（STZ）制备大鼠2型糖尿病模型。两周后检测机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）,降至基础值80%以下者为2型糖尿病神经病理性疼痛大鼠,记为DNP组（24只）;未降至基础值80%以下者为2型糖尿病无神经病理性疼痛大鼠,记为DA组（18只）。另取18只大鼠为对照（control,C）组,普通饲料喂养。于确定DA与DNP分组后的第3、7和14天,测定机械缩足阈值（MWT）和热缩足潜伏期（TWL）,并在行为学检测结束后各组随机取6只大鼠处死,取L4~L6脊髓膨大,采用Western blot法检测自噬特异性蛋白微管相关蛋白1（Beclin-1）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）和P62的表达。另取6只7 d DNP组大鼠采用免疫荧光双染法检测脊髓背角P62与小胶质细胞、星形胶质细胞、神经元的共表达情况。结果：连续8周喂养高糖高脂饲料的SD大鼠的血浆胰岛素水平升高,胰岛素敏感指数下调,表明出现胰岛素抵抗;在腹腔注射STZ后,血糖升高达到2型糖尿病诊断标准（≥16.7 mmol/L）;与C组、DA组比较,DNP组大鼠在第3、7和14天时MWT降低,TWL缩短,并且脊髓背角LC3-Ⅱ、Beclin-1表达上调,P62表达下降（P<0.05）。免疫荧光双染色显示,P62在脊髓背角表达,主要与神经元共存,少量与小胶质细胞共存,几乎不与星形胶质细胞共表达。结论：2型糖尿病神经病理性疼痛大鼠脊髓LC3-Ⅱ、Beclin-1和P62表达的改变提示脊髓自噬功能激活;脊髓背角中神经元自噬激活在2型糖尿病大鼠DNP的发生和发展起着关键作用。     

Distribution of alpha 1 subunit isoform of (Na,K)-ATPase in the rat spinal cord

Three isoforms of the alpha subunit of (Na,K)-ATPase have been identified in the rat central nervous system. Using a probe specific for the alpha 1 isoform, mRNA levels were measured from five sections of the rat spinal cord using slot blot techniques. Assigning a value of 1 to the slope obtained from the cervical section, the upper thoracic section was 2.6 times higher; the midthoracic section was 4.5 times higher; the lower thoracic section was 2.6 times higher; and the lumbar section was 1.7 times higher. The results suggest that alpha 1 isoform mRNA levels are not uniform throughout the spinal cord. In situ hybridization techniques showed that alpha 1 isoform mRNA was diffusely abundant in glial and central canal ependymal cells, while labeled neurons were localized exclusively in lateraily located anterior horn neurons in cervical, thoracic, and lumbar segments and in ventromedial neurons in mid-thoracic spinal cord. Also, dorsal root ganglia neurons were extensively labeled at all segments.Special issue dedicated to Dr. Bernard W. Agranoff.     

大鼠脊髓挤压伤后NT-3、NT-4在腹角运动神经元表达的变化

我们前面的研究已证实,神经生长因子和脑源性神经营养因子与成年大鼠挤压性脊髓损伤修复有关。在本研究中,通过免疫组织化学ABC法,我们探讨了挤压伤后不同时间脊髓腹角神经元NT-3和NT-4的表达。结果显示,在对照组,NT-3和NT-4的阳性反应主要分布在脊髓腹角神经元,挤压性脊髓损伤后7天和21天,NT-3阳性神经元的数量较对照组和24小时组明显增加,比较之,损伤后24小时和7天,NT-4阳性神经元的数量已较正常者增多,且NT-T的反应强度21天者较24小时和7天者有增多。结果表明NT-3和NT-4的表达在挤压性损伤后的脊髓腹角神经元被不同程度地上调,提示NT-3和NT-4可能与挤压性脊髓损伤修复有关。     

Recombinant DNA Vaccine Against Inhibition of Neurite Outgrowth Promotes Functional Recovery Associated with Endogeous NGF Expression in Spinal Cord Hemisected Adult Rats

Axonal regeneration across the site of spinal cord lesion is often aborted in adult mammalian species. The use of DNA vaccine to nullify the inhibitory molecules has been shown to be effective in promoting axonal regeneration in injured spinal cord. The possible molecular mechanisms, however, remain to be elucidated. The present study showed that the administration of recombinant DNA vaccine encoding multiple domains, Nogo-66, Nogo-N, TnR, and MAG, significantly improved hindlimb locomotor functions in rats subjected to ablation of the dorsal halves of the cord. Western blot analysis demonstrated that nerve growth factor (NGF) levels in the spinal cord of immunized rats were significantly upregulated than those of control rats. Immunohistochemistry as well as in situ hybridization confirmed that NGF was expressed in neurons of the spinal cord. These findings indicated that functional recovery in immunized rats could be correlated with endogeous NGF expression in hemisected rat spinal cords. Y. Zhang and C.-G. Hao contributed equally to this work.     

Decreased Expression and Role of GRK6 in Spinal Cord of Rats After Chronic Constriction Injury

Nerve injury and inflammation can both induce neuropathic pain via the production of pro-inflammatory cytokines. In the process, G protein-coupled receptors (GPCRs) were involved in pain signal transduction. GPCR kinase (GRK) 6 is a member of the GRK family that regulates agonist-induced desensitization and signaling of GPCRs. However, its expression and function in neuropathic pain have not been reported. In this study, we performed a chronic constriction injury (CCI) model in adult male rats and investigated the dynamic change of GRK6 expression in spinal cord. GRK6 was predominantly expressed in the superficial layers of the lumbar spinal cord dorsal horn neurons and its expression was decreased bilaterally following induction of CCI. The changes of GRK6 were mainly in IB4 and P substrate positive areas in spinal cord dorsal horn. And over-expression of GRK6 in spinal cord by lentivirus intrathecal injection attenuated the pain response induced by CCI. In addition, the level of TNF-α underwent the negative pattern of GRK6 in spinal cord. And neutralized TNF-α by antibody intrathecal injection up-regulated GRK6 expression and attenuated the mechanical allodynia and heat hyperalgesia in CCI model. All the data indicated that down-regulation of neuronal GRK6 expression induced by cytokine may be a potential mechanism that contributes to increasing neuronal signaling in neuropathic pain.