SelS高表达保护人脐静脉内皮细胞免于H2O2诱导的细胞损伤

采用以下方法探讨SelS在内皮细胞中的表达和作用：将SelS基因克隆到真核表达载体pLNCX2，RT-PCR、XhoⅠ/ClaⅠ双酶切以及DNA序列分析验证目的基因；利用脂质体转染技术将pLNCX2-SelS或pLNCX2转染至人脐静脉内皮细胞(ECV₃₀₄细胞)，RT-PCR检测重组基因SelS的表达；MTT方法检测转染后过氧化氢(H₂O₂)对内皮细胞增殖能力的影响；硫代巴比妥酸法测定暴露于H₂O₂中不同转染组细胞脂质过氧化产物丙二醛含量. 结果表明：成功构建真核表达载体pLNCX2-SelS；转染后重组SelS mRNA表达水平是内源性水平的1.76倍；H₂O₂对ECV₃₀₄细胞损伤后，高表达SelS组细胞活性增强、H₂O₂诱导产生的丙二醛减少. 上述结果表明，高表达SelS可保护内皮细胞免于H₂O₂诱导的细胞损伤，其作用机制与抗氧化有关.     

鸡卵清蛋白基因启动子调控GFP基因在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞的表达

特异性扩增家鸡卵清蛋白基因上游调控序列 1340bp～ +16 5 5bp片段和第一内含子 +49bp～ +16 5 5bp片段 ,去除pG FP N2载体自身的CMV启动子 ,分别构建了P_2.9koval GFP和P_1.5koval GFP两种表达载体 ,经测序和酶切鉴定表达载体构建正确。采用脂质体转染法分别将这两种载体、pGFP N2 (阳性对照 )质粒及阴性对照转染鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞。用荧光倒置显微镜观测绿色荧光蛋白的表达。结果表明 :两种表达质粒在鸡原代输卵管上皮细胞和中国仓鼠卵巢细胞中都可以表达荧光蛋白。结果既显示卵清蛋白第一内含子对基因的表达起到一定的调控作用 ,也显示卵清蛋白启动子对输卵管上皮细胞和卵巢细胞不存在特异性 ,并且不存在种属差异性。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nest Polymerase Chain Reaction ,nPCR）技术扩增出当前猪瘟流行毒（广西玉林株,GXYL）与中国猪瘟兔化弱毒（C-株）兔脾组织毒E₂基因的主要抗原区,将其克隆到表达载体pP_ROEX-HTb中,获得重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明,插入的位置、大小和读码框均正确。 SDS-PAGE检测表明,经重组质粒pP_ROEX-GXYL和pP_ROEX-C转化、诱导的受体菌能表达E₂基因主要抗原区蛋白,Western-blot检测表明,诱导表达的抗原蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应。      

PKCγ过表达诱导C3H10T1/2细胞生长失控的初探

通过DNA重组构建蛋白激酶C_γ(PKC_γ)亚类的重组质粒并经基因转染技术和DNA印迹、蛋白质印迹与PKC活性分析,获得了过表达PKC_γ的C₃H₁₀T_1/2细胞——NCP4.NCP4细胞生长速率提高,流式细胞光度术检测表明,NCP4细胞G1期百分率下降,S期和G2+M期百分率升高,与对照组细胞相比,血清依赖性明显下降,贴壁依赖性降低,在软琼脂中形成小集落,出现部分转化表型.进一步检测,首次观察到NCP4细胞中癌基因c-sis表达明显增强,这可能是NCP4细胞血清依赖性下降的分子机理之一.实验表明,在正常C₃H₁₀T_1/2细胞中PKC_γ的过表达可直接导致细胞增殖加速并可诱导出现部分转化特征.     

人可溶性CD14基因克隆表达及功能研究

利用反转录PCR技术,从U₉₃₇细胞总RNA中,扩增编码人可溶性CD₁₄的基因序列,构建了重组表达质粒pEF1/HisC/sCD₁₄^348aa;用脂质体转染法,实现了在真核细胞中的高效表达;用免疫亲和层析纯化表达产物,纯度达90%以上;LPS刺激U₉₃₇细胞产生CD₁₄的变化,证明了表达产物具有结合LPS的功能。     

非受体型酪氨酸激酶JAK1基因真核表达质粒的构建与真核表达

[目的]构建非受体型酪氨酸激酶JAK1(nonreceptor tyrosine kinase-JAK1)基因真核表达质粒pcDNA4.0-HisJAK1,并转染293T细胞进行真核表达。[方法]从Hela细胞中提取总的RNA,通过RT-PCR获得JAK1基因全长c DNA序列,并将其克隆至真核表达载体pcDNA4.0-His中,构建重组质粒pcDNA4.0-His-JAK1。将真核重组表达质粒转染293T细胞,转染48 h后,在荧光显微镜下观察转染情况。免疫印迹法检测JAK1蛋白转染24 h、36 h与48 h在293T细胞中的表达。[结果]经双酶切与质粒PCR鉴定质粒克隆正确,测序鉴定序列中第2199位碱基A突变为G,为同义突变,不影响氨基酸序列。转染293T细胞48 h后,间接免疫荧光实验显示在293T细胞中检测到绿色荧光。免疫印迹检测可见大小约为133 kDa的目的蛋白。[结论]成功获得JAK1基因全长序列,并成功构建pcDNA4.0-HisJAK1真核重组表达质粒,并在真核细胞293T中获得有效表达,为进一步研究JAK1蛋白质相互作用奠定了基础。     

人PINK1-shRNA载体的构建及对神经母细胞瘤细胞线粒体的影响

摘要 目的：构建筛选人源靶向特异PINK1-shRNA敲减质粒,转染神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞并验证该质粒转染后对PINK1基因的敲减效率,观察对细胞线粒体形态的影响。方法：构建两对人源PINK1-shRNA序列(编号分别为PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42),将这2对干扰序列连接在载体上形成重组载体,经测序验证后,将空载体和两对敲减质粒分别转染SH-SY5Y细胞,获得基因敲减的细胞模型,用CCK-8法检测细胞的存活率,用荧光定量PCR方法确定PINK1基因的敲减效率,用蛋白质免疫印迹法验证细胞内PINK1的表达水平是否发生改变,用激光共聚焦显微镜观察线粒体的形态是否发生了改变。结果：我们提取的质粒,经测序结果显示,质粒载体构建成功;转染细胞后,CCK-8 法检测细胞存活率发生了降低,与正常组比较,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒组,细胞的存活率分别降低了13.7%（P＜0.05）和14.1%（P＜0.05）;荧光定量PCR结果显示,与正常组相比,PINK1-shRNA-39组和PINK1-shRNA-42组敲减质粒转染的细胞内PINK1基因的表达分别降低了24.1%（P＜0.01）和36.7%（P＜0.01）;蛋白质印迹法结果显示,与正常组相比,两对质粒分别转染细胞后,PINK1-shRNA-39和PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平降低,差异有统计学意义(P＜0.01),PINK1-shRNA-42敲减质粒转染的细胞内PINK1蛋白的表达水平有效降低更明显;与正常组比较,激光共聚焦显微镜观察到基因敲减两组细胞的线粒体部分发生断裂,碎片较多,基因敲减两组的线粒体的形态因子显著降低,差异有统计学意义（P＜ 0.01）。结论：成功构建了人源的PINK1基因敲减的质粒,并将敲减的质粒成功转染至SH-SY5Y 细胞中,细胞内PINK1基因的mRNA和蛋白的表达水平降低,且细胞线粒体的形态发生了改变。     

H18杂交瘤抗凋亡能力的改造

利用PCR从pGEMTbcl-X_L质粒中获得bcl-X_L基因,构建真核表达载体pEF-bcl-X^{L,脂质体法转染杂交瘤细胞,G418筛选稳定表达株,Western blotting检测目的蛋白表达,流式细胞仪检测Bcl-X_L提高杂交瘤抗正丁酸钠诱导凋亡的功能。 将构建的编码鼠bcl-X_L基因的真核表达载体pEF-bcl-X_L,转染H18细胞后,获得稳定的表达株细胞;稳定表达Bcl-X_L的细胞具有抗正丁酸钠诱导凋亡的功能。鼠bcl-X_L基因在杂交瘤细胞中稳定表达,提高了杂交瘤抗凋亡的能力,对高密度大规模培养杂交瘤细胞具有重要意义。}     

EGFP/SDCT1融合蛋白表达、亚细胞定位信号分析、组织分布及电生理功能研究

从正常人肾中克隆低亲和力钠离子依赖二羧酸共转运蛋白 1(sodium-dependent dicarboxylate co-transporter 1, SDCT1, NADC1)全长基因, 并将其和N端及C端缺失突变的SDCT1基因分别插入增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)表达载体中构建EGFP/SDCT1融合蛋白真核表达载体, 然后将它们转染到人肾小管上皮细胞HKC中表达并用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的亚细胞定位情况以确定其定位信号. 双重PCR分析证实融合基因已整合到细胞基因组中, Western blot显示融合基因已在细胞中得到表达. 共聚焦显微镜分析显示正常人SDCT1蛋白主要定位于细胞膜上, 与生物信息学的预测结果一致, 而C端缺失的SDCT1基因转染的细胞, 其绿色荧光位于细胞质, N端缺失基因转染的细胞, 其绿色荧光主要位于细胞膜上. 将体外转录的融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达并用双电极电压钳技术记录细胞跨膜电流, 结果在卵细胞膜上测定出了Na⁺内向电流. 免疫组化结果显示SDCT1主要表达于人近端肾小管上皮细胞的管腔侧, 而在远端肾小管、集合管、肾间质和肾小球中未见SDCT1的表达. 上述研究表明, 正常人SDCT1蛋白定位于近端肾小管上皮细胞的管腔侧膜上, SDCT1蛋白的C端部分对于其合成后的迁移及靶向定位是必需的, 人SDCT1蛋白的细胞膜定位序列可能位于其C端部分.     

转基因枸杞表达HIV-1壳体蛋白病毒样颗粒疫苗表达载体的构建

利用PCR技术扩增出人免疫缺陷病毒HIV-1MA₄-CA融合基因,将其克隆到pGEM-T载体中,测定其核苷酸序列,并推导其氨基酸序列。该基因全长为450bp,与已发表的HIV-1的全序列基因(AF324493)完全同源,编码一个含150个氨基酸残基的蛋白质。将该基因与分泌型表达载体pCAMBIA1305.2连接,同时将水稻中富含甘氨酸蛋白的信号肽序列(GRP)引入MA₄-CA融合基因,构建了含MA₄-CA基因的植物分泌表达载体pCAMBIA1305.2-MA₄-CA。     

SARS—CoVSars7a和EGFP融合蛋白真核表达载体构建及其表达

根据SARS-CoV sars7a基因设计并化学合成部分重叠引物,经二轮PCR获得sars7a基因片段,以此片段为模板并利用一对带有Kozak序列及删除终止密码的引物进行PCR,获得产物与pEGFP-N1载体连接,使sars7a基因位于．EGFP的基因上游,得到含编码Sars7a-EGFP融合蛋白基因的哺乳动物细胞表达载体。采用细胞核转染技术将重组表达载体转染K562细胞,以流式细胞仪和共聚焦显微镜分析,可检测到EGFP的绿色荧光,表明Sars7a—EGFP得到表达,该蛋白分布于整个细胞,提示Sars7a并非膜蛋白,更可能是胞浆蛋白。此外,该蛋白的表达对K562细胞凋亡无明显影响。     

ZNF230/荧光蛋白融合基因表达载体的构建及其在Cos细胞中的表达与定位

为了用绿色荧光蛋白标记观察人类无精症相关基因ZNF230在Cos7细胞中的蛋白质表达及定位,用PCR方法扩增得到突变的人和小鼠mt ZNF230和mt znf230基因,使其3′端的终止密码TGA突变为TGG,并装入T 载体,双酶切后通过定向克隆将其与真核表达载体pEGFP N1的绿色荧光蛋白(greenfluorescenceprotein,GFP)基因融合,构建了ZNF230—荧光蛋白融合基因表达载体。然后经真核表达质粒-脂质体介导,导入Cos7细胞系。荧光显微镜观察显示:在空白载体pEGFP N1转染的Cos细胞中荧光布满整个细胞,而在转染阳性载体pEGFP ZNF230和pEGFP znf230的Cos细胞中荧光主要聚集在细胞核中。表明转染的Cos细胞系能高效表达人ZNF230和小鼠znf230蛋白,ZNF230基因表达的蛋白定位于细胞核内。     

异源基因α1,3半乳糖转移酶与增强型绿色荧光蛋白融合对荧光蛋白表达的影响

目的 研究异源(猪)基因α1,3半乳糖转移酶(3GT)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因形成的融合蛋白对其荧光表达量的影响.方法 BamHI,EcoRI酶切pcDNA3.1-α1,3GT重组载体后,回收含α1,3GT的片段,与BamHI、EcoRI酶切回收的pEGFP-N1载体连接,并酶切、测序鉴定重组真核表达载体p...     

绿色荧光蛋白在草鱼肾细胞中的表达

应用阳离子脂质体介导法,将含绿色荧光蛋白（GFP）基因的质粒pEGFP-N1转染到培养成单层的草鱼肾细胞（CIK）中,通过荧光倒置显微镜和特异性RT-PCR方法检测GFP的表达.在荧光倒置显微镜下可见CIK细胞的胞质和胞核均呈现绿色荧光,且细胞核的绿色荧光强度强于细胞质.转染细胞中的转录产物经RT-PCR扩增后,凝胶电泳鉴定出与GFP基因片段分子量大小一致的条带,经测序证明其为GFP基因序列.结果表明,GFP基因可以在草鱼CIK细胞内高效率成功表达,为构建以GFP为报告基因的真核重组质粒及研究草鱼出血病DNA疫苗奠定了重要的基础.     

Kras突变基因真核表达载体的构建及在不同肝细胞株中的表达

目的：构建携带突变Kras基因,以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）为报告基因的重组真核表达载体,并导入两种不同的肝细胞株中表达。方法：PCR扩增突变Kras目的基因,将该全长基因定向克隆至真核表达载体pEGFP-N1上,构建重组质粒载体。并利用脂质体转染人肝癌细胞株Huh7．5和鸡肝癌细胞株LMH,在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察Kras-EGFP融合蛋白在细胞中的表达;用WesternBlotting方法验证Kras蛋白水平的表达。结果：酶切和测序证实pEGFP—N1-Kras重组质粒构建正确,将EGFP报告基因融合在突变的Kras基因的3’端;在Huh7．5和LMH中均观察到了绿色荧光,转染率分别为19％和53％;WesternBlott—ing也检测到融合蛋白的表达。结论：通过基因克隆方法成功构建了pEGFP—N1-Kras重组质粒载体,并且在Huh7．5和LMH中均稳定表达,为下一步筛选针对突变Kras基因的靶向药物奠定了基础。     

FAM92A1-289基因的真核表达载体构建和亚细胞定位

利用PCR方法扩增FAM92A1-289全长,经BamH I和Xho I酶切后连接入pEGFP-N1真核表达载体,构建pEGFP-N1-FAM92A1-289重组表达质粒,转染Hela细胞,利用荧光显微镜观察FAM92A1-289在细胞中的定位。经双酶切和核酸序列分析证实重组质粒包含有正确编码的FAM92A1-289读码框。荧光显微镜观察到空质粒pEGFP-N1转染后,整个细胞内弥散绿色荧光,而转染pEGFP-N1-FAM92A1-289重组载体后,可见绿色荧光分布于Hela细胞核中,显示FAM92A1-289定位于细胞核。成功构建人FAM92A1-289真核表达载体,FAM92A1-289定位于哺乳细胞的细胞核中。     

人SDCT2蛋白亚细胞定位信号分析

为了确定人高亲和力钠离子依赖性二羧酸共转运蛋白（high-affinity sodium-dependent dicarboxylate co-transporter, SDCT2,NaDC3）在细胞内的定位,构建了SDCT2与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合蛋白表达载体,并转染肾小管上皮细胞LLC-PK1,激光共聚焦显微镜观察显示,SDCT2蛋白主要定位于细胞的基底侧膜上.同时将SDCT2-EGFP融合基因mRNA显微注射到爪蟾卵母细胞中表达,可见融合蛋白的绿色荧光仅分布在细胞膜上.为了进一步确定该蛋白质的亚细胞定位信号序列,将SDCT2基因的N端及C端分别缺失,并构建缺失突变体与EGFP的融合蛋白表达载体,将它们转染到LLC-PK1中,观察SDCT2 缺失体在细胞内的分布情况.结果显示,N端缺失的SDCT2蛋白主要位于细胞质中,顶膜和基底侧膜上也有表达;C端缺失的SDCT2蛋白主要位于基底侧膜上,顶膜几乎没有表达,细胞质中表达很少.免疫组化结果也显示,SDCT2只表达于人近端肾小管上皮细胞的基底侧膜.这表明SDCT2蛋白的N端序列对其亚细胞定位是必需的,人SDCT2蛋白的基底膜定位信号位于N端序列中.     

绿色荧光蛋白与人肾脏NaDC3融合基因的构建及其在肾小管上皮细胞中的定位

本采用RT-PCR方法从人的正常肾组织中扩增出hNaDC3基因全长cDNA序列,采用基因重组技术将hNaDC3基因和绿色荧光蛋白基因融合,通过真核表达质粒—脂质体介导,导入LLC-PKl细胞系,激光共聚焦显微镜动态观察GFP—hNaDC3的定位情况。结果显示PKGFP-C3空白质粒转染的LLC—PKl细胞表达了GFP,GFP在胞内分布以核浆为主,呈均匀致密的细颗粒荧光,胞核染色强,核仁荧光稀少,界线清楚。而pKGFP-C3-hNaDC3转染细胞株的绿色荧光蛋白,转染后第1天混合分布于细胞浆和细胞膜,以粗颗粒荧光为主,两界限不清楚,胞浆中可见未染色的圆形空洞,未见胞核染色;第3天主要聚集于细胞膜,核周的胞浆中可见粗颗粒荧光物质,胞浆和胞膜界线清楚,胞核亦未见绿色荧光蛋白;第5天清晰聚集于细胞膜,细胞膜连接至网状。因此hNaDC3蛋白在细胞质中生成后,定位于细胞膜并稳定表达。     

USP22基因克隆及其融合蛋白真核表达载体的构建

目的克隆人类泛素水解酶22（ubiquitin—specific processing enzyme22,USP22）基因,构建与绿色荧光蛋白融合表达的真核载体。方法利用RT—PCR技术以HeLa细胞总RNA为模板分别扩增USP22基因cDNA序列两片段,依次插入真核表达载体pEGFP—N1;重组质粒转染HEK293T细胞,观察融合蛋白表达及绿色荧光的分布。结果测序结果显示USP22序列与GenBank收录数据一致,酶切显示重组质粒pEG—FP—USP22构建无误,质粒转染后有80％左右HEK293T细胞表达绿色荧光,且在胞质与胞核中广泛分布。结论成功克隆USP22基因并构建与GFP融合表达的真核载体,为进一步深入研究USP22基因的生物学功能奠定了基础。