传染性支气管炎病毒核衣壳蛋白基因克隆及在E.coli中的表达

核衣壳蛋白基因 (N基因 )是传染性支气管炎病毒的重要结构基因 .根据已报道的序列设计引物 ,利用RT PCR技术从病毒RNA中扩增和克隆到了N基因的cDNA ,并测定了核苷酸序列 .克隆的N基因片段ORF全长 12 30bp ,编码 4 0 9个氨基酸 .将该片段序列与其他IBV病毒株比较 ,核苷酸的同一性为 87 0 %～ 98 6 %,氨基酸的同一性为 91 0 %～ 98 1%.将该cDNA亚克隆到pBV2 2 0表达载体 ,转化大肠杆菌DH5α菌株 ,Western印迹检测 ,获得了分子量约 4 5kD表达蛋白     

野生茄子（Solanum torvum）抗黄萎病相关基因Sto Vel的克隆与分析

采用RT—PCR和RAcE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVel,其cDNA全长3400bp,含有3153bp的完整开放阅读框,编码1051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Vel编码的氨基酸序列同源性分别为82％、81％和80％,且有很高的功能区段保守性。将该cDNA全长序列提交Gen Bank,登陆号为DQ020574。半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少。     

光皮桦中4-香豆酸辅酶A连接酶基因B14CL的克隆和表达分析

以从光皮桦茎叶组织提取的mRNA为模板，根据其他已克隆到的阔叶类树种中4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）基因的同源序列设计兼并引物，进行RT—PCR扩增，获得部分基因片段，然后结合5’，3’RACE方法从光皮桦中扩增出1个4CL基因的全长cDNA序列，命名为B14CL。该基因cDNA全长为1983bp（GenBank登录号FJ410448），具有完整的开放阅读框架（69—1697bp），编码蛋白为542个氨基酸，包含一个AMP结合功能域和一个含有12个氨基酸的功能基序。与其他植物中的4CL进行同源性比对的结果显示，B14CL蛋白与东北白桦的同源性最高，达到了98％。该基因在光皮桦的根和茎中表达量较高，而在花和叶中的表达量低。     

反向PCR克隆黑根霉R306△6-脂肪酸脱饱和酶基因

利用简并引物扩增出Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因的核心序列,设计与核心序列互补的反向引物,以5′端带磷酸基团的引物进行反转录cDNA,然后在 12 ℃下环化cDNA,并以此作为模板进行反向PCR,引物的延伸方向自核心区向环化分子的未知序列进行,扩增出核心区的上下游序列.应用该方法扩增并测定了黑根霉R306的Δ6-脂肪酸脱饱和酶基因全序列.并对酶的低温适应机制在氨基酸序列上进行了分析.     

千年桐SAD基因克隆与分析及其丝状真菌表达载体构建

以发育中的千年桐种子总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增得到硬脂酰脱饱和酶基因SAD的cDNA序列。该序列长度为1 191 bp,编码396个氨基酸。推测的分子量为45 541.01 u,等电点pI为6.05。BLAST分析表明,该cDNA序列与其它已登录的SAD基因cDNA序列一致性最高可达93.1%;编码的氨基酸蛋白序列性一致最高为89%。同时,构建了由构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的gpdA启动子驱动的丝状真菌表达载体,通过冻融法转入农杆菌中,PCR鉴定表明,pBAR-SAD已转入农杆菌EHA105中,成功构建了农杆菌工程菌株。     

甘菊BADH基因cDNA的克隆及在盐胁迫下的表达

利用PCR、RT—PCR和PCR—RACE技术,从菊科植物甘菊（Dendranthema lavandulifolium）中克隆到2个甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase,BADH）基因的同源基因,分别命名为DlBADH1和DlBADH2,GenBank登录号分别为DQ011151和DQ011152。DlBADH1的cDNA全长1821bp,其开放阅读框编码503个氨基酸的蛋白质;DlBADH2全长1918bp,编码506个氨基酸的蛋白质。两个基因核苷酸序列的同源性为97％,推导的氨基酸序列的同源性为98％。与已发表的其它植物BADH基因氨基酸序列的同源性在64％以上。在推导的氨基酸序列中,均含有醛脱氢酶所具有的高度保守的十肽（VTLELGGKSP）以及与酶功能有关的半胱氨酸残基（C）。在推导的氨基酸序列的系统关系中,甘菊位于其它双子叶植物和单子叶植物之间,与其植物分类的系统关系相吻合。RT—PCR—Southern半定量表达分析表明,甘菊BADH基因家族中存在表达受盐诱导的成员。     

水稻葡萄糖-6-磷酸脱氢酶cDNA的电子克隆

电子克隆是基因克隆的新策略,以小麦胞质葡萄糖－6－磷酸脱氢酶cDNA(Tagpdl克隆）序列为信息探针,在GenBank水稻nr数据库中找到高度同源的水稻基因组序列,通过人工序列拼接及RT-PCR确认得到了水稻该基因的全长cDNA序列,命名为OsG6PDH,OsG6PDH与小麦Tagpdl克隆的DNA一致率为88％,推导的氨基酸序列与小麦,番茄,烟草的胞质葡萄糖－6－磷酸脱氢酶基因的一致率分别为89％,79％,80％,经RT－PCR表达谱分析,OsG6PDH在水稻幼穗,胚,根,叶中都有表达,在幼穗与根中表达略高,另外,讨论了利用水稻基因组信息的电子克隆方法克隆水稻功能基因的可行性。     

金龟子绿僵菌羧基转运蛋白基因MaJEN1及其启动子的克隆与分析

用YADE法扩增了球孢白僵菌T—DNA插入突变体T12中与T—DNA左边界相连的基因组序列。在此基础上得到了金龟子绿僵菌的羧基转运蛋白的全长cDNA,MaJEN1。MaJEN1全长1695bp,其中含有长为1524bp的开放阅读框(0RF),编码508个氨基酸的蛋白。氨基酸序列与粗糙脉孢霉和啤酒酵母菌的羧基转运蛋白JEN1相似性分别为69％和31％。采用PCR扩增得到了MaJEN1的基因组序列GMaJEN1,序列分析发现,GMaJEN1含有两个内含子。Southern杂交发现GMaJEN1在金龟子绿僵菌基因组上为单拷贝。利用RT—PCR法对MaJEN1的表达特性进行了分析,结果表明MaJEN1在蟑螂壳诱导培养基中表达,在该培养基中的表达受葡糖糖抑制。进一步采用YADE法得到了长为1626bp的GMaJEN1上游序列,其中含有可能的葡萄糖抑制调控序列。     

人参皂苷生物合成相关新基因GBR6的cDNA克隆及序列分析

从人参根组织中分离总RNA,使用RT—PCR扩增出人参皂苷生物合成相关基因GBR6开放阅读框(ORF)cDNA片断,并将其定向克隆入原核高效表达载体pQE30,阳性克隆经BamHⅠ和PstⅠ双酶切鉴定、测序验证与已知的GBR6ORF序列完全一致．因而成功构建了pQE30-GBR60RF融合原核表达载体,为下一步进行GBR6功能表达分析奠定了基础．     

甜瓜抗霜霉病基因同源序列克隆与分析

采用RT—PCR扩增的方法,从高抗霜霉病甜瓜品种‘日本安农二号’中克隆到约3kb的cDNA片段（命名为MRGH-D,该基因是一个连续的通读编码框,编码1007个氨基酸。推测的蛋白质分子量为113．7kDa,等电点为7．88,蛋白质预测无跨膜区。根据推测的氨基酸序列,该基因属于TIR—NBS—LRR类抗病基因,具有TIR-NBS—LRR类抗病基因所有的保守结构域。核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析结果显示,MRGH-J与甜瓜抗病基因的同源序列MRGHl2及抗霜霉病相关基因mp-19均具有高达99％的同源性,推测该基因可能在甜瓜抗霜霉病中起作用。     

玉米FAD2基因RNA干涉表达载体的构建及转化

根据已克隆的ZmFAD2基因(GenBank登陆号:DQ496227)设计引物,通过RT-PCR扩增得到120 bp的特异性基因片段作为hpRNA干涉片段。利用pUCCRNA i与pUb i.cas为中间载体,成功构建了含Ub iqu itin启动子和hpRNA i片段的干涉表达载体p1 300 UFIFN。以自主选育的高油玉米自交系幼胚为材料,诱导、继代出胚性愈伤组织,利用携带p1 300 UFIFN质粒的根癌农杆菌LBA4404对其进行遗传转化。对抗性植株进行PCR检测,共获得6株转基因阳性株。     

一类依赖于NAD的玉米胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其序列分析

苹果酸脱氢酶普遍存在于各种生物中,它负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换.根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布及其生理功能的不同,苹果酸脱氢酶在高等植物中可以区分出不同的类型,依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶是其中研究较少的一类.根据已发表的其他高等植物的依赖于NAD的胞质型苹果酸脱氢酶基因的保守序列,运用SMART RACE RT-PCR技术,从玉米叶片中分离了cyMDH 的1 264 bp全长cDNA序列,通过生物信息学分析发现,该序列含有一个999 bp的完整的开放阅读框,其共编码332个氨基酸(GenBank登陆号 EU625276).序列联配与树状分析结果表明,该玉米cyMDH 序列与多个物种的cyMDH 基因具有高度的同源性.组织特异性表达分析显示MDH基因在玉米叶片中表达量最高,在茎、根中亦有低水平表达.本研究将为更深入的研究玉米cyMDH 基因的分子调控机理奠定基础.     

雅致枝霉△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

根据真菌△^6 -脂肪酸脱氢酶基因保守的组氨酸Ⅱ区和Ⅲ区附近保守序列设计兼并引物进行RT-PCR,得到雅致枝霉（Thamnidium elegans）As3．2806△^6 -脂肪酸脱氢酶基因459bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术（RACE）向两端延伸得到1504bp的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个1377bp、编码459个氨基酸的开放阅读框TED6。推测的氨基酸序列与已知其他真菌的△^6 -脂肪酸脱氧酶基因的氨基酸序列比对,具有3个组氨酸保守区、2个疏水区及N末端细胞色素b5融合区。将此编码区序列亚克隆到酿酒酵母缺陷型菌株INVSel的表达载体pYES2.0中,构建表达载体pYTED6,并在酿酒酵母INVSel中异源表达。通过气相色谱（GC）和气相色谱,质谱（GC-MS）分析表明,该序列在酿酒酵母中获得表达,产生γ-亚麻酸（GLA）的含量占酵母总脂肪酸的7．5％。证明此序列编码的蛋白能将外加的亚油酸转化为γ-亚麻酸,是一个新的有功能的△^6 -脂肪酸脱氢酶基因（GenBank．AY941161）。     

Sequence of a cDNA encoding turtle high mobility group 1 protein

In order to understand sequence information about turtle HMG1 gene, a cDNA encoding HMG1 protein of the Chinese soft-shell turtle (Pelodiscus sinensis) was amplified by RT-PCR from kidney total RNA, and was cloned, sequenced and analyzed. The results revealed that the open reading frame (ORF) of turtle HMG1 cDNA is 606 bp long. The ORF codifies 202 amino acid residues, from which two DNA-binding domains and one polyacidic region are derived. The DNA-binding domains share higher amino acid identity with homologues sequences of chicken (96.5%) and mammalian (74%) than homologues sequence of rainbow trout (67%). The polyacidic region shows 84.6% amino acid homology with the equivalent region of chicken HMG1 cDNA. Turtle HMG1 protein contains 3 Cys residues located at completely conserved positions. Conservation in sequence and structure suggests that the functions of turtle HMG1 cDNA may be highly conserved during evolution. To our knowledge, this is the first report of HMG1 cDNA sequence in any reptilian.     

桑泛素延伸蛋白基因片段的克隆及序列分析

目的:利用3’RACE技术克隆植物泛素基因,是进一步研究其功能的基础。方法:本研究从桑树(丰驰桑)(Morus bomby-cis)幼叶中提取总RNA,反转录成cDNA,根据已报道的泛素基因序列设计1条正向引物,利用3’RACE(Rapid Amplification of cDNAEnd)技术进行扩增。结果:扩增出1条690 bp的泛素基因片段。该片段5’端为编码156个氨基酸残基的阅读框,3’末端有219bp的非翻译区。结论:同源分析表明,此cDNA序列为泛素延伸蛋白基因(Genebank登录号为DQ839403)。用Genedoc软件对该片段编码的氨基酸序列进行同源性分析的结果表明:桑树泛素延伸蛋白与马铃薯、烟草、陆地棉、黄瓜的泛素延伸蛋白以及苜蓿的核糖体S27A蛋白的同源性都在96%以上。     

海洋真菌Thraustochytrium sp.FJN-10 Δ~4脱饱和酶基因的cDNA克隆及结构分析

海洋真菌Thraustochytriumsp.FJN-10是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA,C22:6n-3)的高产菌株。为阐明其DHA生物合成机制及采用基因工程技术提高DHA生物合成能力,通过RT-PCR扩增了DHA生物合成相关脱饱和酶基因的保守区,采用cDNA末端扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)获取全长基因,结果分析表明其克隆基因为Δ4脂肪酸脱饱和酶基因,开放阅读框由1560个核苷酸组成,共编码519个氨基酸,这是Thraus-tochytriumsp.FJN-10Δ4脂肪酸脱饱和酶基因研究的首次报道。     

Cloning and functional expression of a cDNA encoding a metabolic acyl-CoA delta 9-desaturase of the cabbage looper moth, Trichoplusia ni.

Acyl-CoA delta 9-desaturases play essential roles in fatty acid metabolism and the regulation of cell membrane fluidity. In this research, a cDNA sequence was obtained from Trichoplusia ni adult fat body mRNA by using RT-PCR with degenerate primers based on other characterized delta 9-desaturase sequences. The remainder of the sequence was amplified using 3'- and 5'-RACE. A 1439 bp cDNA reconstructed from three overlapping PCR products contains an ORF encoding a 353-amino acids (aa) protein that shows clear homology (greater than 50% aa identity and greater than 65% aa similarity to characterized insect and vertebrate desaturases). The ORF of this cDNA was subcloned into an expression vector, which relieved the unsaturated fatty acid (UFA) auxotrophy of a desaturase-deficient yeast strain following genetic transformation. The newly characterized desaturase from T. ni produced fatty acids delta 9-16 and delta 9-18 in a 1:6 ratio, compared to a 5:1 ratio, respectively, with the yeast delta 9 desaturase. A Northern blot hybridization and a RT-PCR experiment showed that temporal and tissue-specific patterns of expression of the corresponding mRNA are distinct from those of the delta 11-desaturase mRNA present in the pheromone glands of adult females. Based on its homology to other desaturases, the widespread distribution of its corresponding mRNA in various tissues, and its functional assay, we conclude that this cDNA encodes the apoprotein corresponding to the desaturase component of the metabolic delta 9-desaturase complex of T. ni.