温度对人肺癌细胞 A549蛋白质表达的影响

肺癌蛋白质组的研究,有助于阐明其发病机制并对肺癌的防治有益。本文从研究人肺癌细胞热休克蛋白的表达情况出发,通过比较37℃、42℃和45℃培养条件下的人肺癌细胞A549总蛋白质的双向电泳图谱,获得3个温度敏感的差异蛋白点,依次命名为P_1、P_2、P_3。对差异蛋白进行MALDI-TOF-MS分析和采用SWISS-PROT数据库中的Peptident软件检索后,初步鉴定P_1与2种醛酮还原酶家族成员相匹配,P_2可能为一种新蛋白,P_3为锌指蛋白11A。     

人肺腺癌细胞A549放射前后蛋白质组测定及分析

筛选了人肺腺癌细胞A549放射前后的差异蛋白质,并探讨了其在放射中的作用.用双向凝胶电泳对人肺腺癌细胞A549放射前后的蛋白质谱进行分析.寻找差异蛋白质.并用MALDI-TOF-MS进行蛋白质鉴定.检测出25个差异蛋白质点,对其中差异2倍以上的7个蛋白质点用MALDI-TOF-MS鉴定,鉴定出锰超氧化物歧化酶B亚型前体、角蛋白8、角蛋白9、dystrobrevin、不均一核糖核蛋白1(HNRPH1)、烯醇化酶1等6种蛋白质.用双向凝胶电泳筛选细胞系放射前后差异蛋白质,筛选的蛋白质与抗氧化、辐射防护、信号转导、RNA加工和转运、能量代谢及细胞凋亡有关,对于揭示放射的分子机制有一定的意义.     

小麦耐盐突变体盐胁迫下的蛋白质组分析

首次采用双向电泳的方法分析1％NaCl胁迫72h的一对小麦耐盐(RH8706-49)及敏盐突变体(H8706-34)的蛋白质组。经过MALDI-TOF分析和数据库检索发现两者在H^ -ATP酶β亚基、谷氨酰胺合成酶前体、OEC33和RuBP羧化酶小亚基等5个候选蛋白存在质或量的差异。这5种蛋白均为叶绿体蛋白,它们很可能在盐胁迫下对维持叶绿体及整个细胞的功能起到重要作用。     

双水相纯化的人肺腺癌和癌旁正常肺组织质膜蛋白质组差异分析

肿瘤标志物对于肺腺癌病人的临床诊断和预后具有重要意义. 本研究根据临床诊断选取人肺腺癌组织和癌旁正常肺组织为研究对象,采用差速离心联合双水相法纯化组织细胞质膜,运用同位素标记相对和绝对定量技术结合高效液相色谱 串联质谱技术,鉴定出肺腺癌组织和癌旁正常肺组织的差异蛋白质41种. 同癌旁正常肺组织相比,18个蛋白质在肺腺癌组织中表达上调,23个蛋白质在肺腺癌组织中表达下调. 生物信息学分析发现,差异质膜蛋白质FLOT1、CAV1和ITGB1均处于蛋白质相互作用网络的重要位置,可能参与了肺腺癌相关信号转导.利用蛋白质印迹和免疫组织化学染色验证,差异蛋白质FLOT1、CAV1和ITGB1在肺腺癌织和癌旁正常肺组织的表达情况,其验证结果与蛋白质组学研究结果一致. 研究结果对肺腺癌诊断标志物和肺腺癌癌变分子机理研究具有重要意义.     

人肺巨细胞癌蛋白质组的二维电泳和计算机图象分析

为优化用于蛋白质组研究的二维电泳技术和计算机图象分析技术 ,以及初步分析比较与肿瘤细胞转移相关的蛋白质 ,以人肺巨细胞癌 (PLA- 80 1 - D、C)高、低转移株作为研究对象 ,应用 IPG-phor进行第一向等电聚焦 ,随后 ,在 Protein IPG conversion Kit上进行垂直 SDS- PAGE的分离 .利用光密度仪对银染的凝胶扫描 ,通过 PDQuest软件进行蛋白斑点检测和配比 .结果表明 :(1 )应用 IPGphor,采用样品直接加入重泡胀溶液的形式 ,增大了溶解性 ,缩短聚焦时间、增大样品负荷量 (分析型 ) ,提高了分辨率 .(2 )比较宽 (p H=3～ 1 0 L)、窄 (p H=4～ 7L)范围 IPG胶条 ,窄 p H范围的 IPG胶条具有较高的分辨率 .(3)比较 PLA- 80 1 - C、D细胞蛋白图谱之间的差异 ,其相关系数为 0 .7339± 0 .0 2 91 ;仅在 PLA- 80 1 - C株出现的蛋白为 1 79个 .     

温度对人肺癌细胞A549蛋白质表达的影响

肺癌蛋白质组的研究,有助于阐明其发病机制并对肺癌的防治有益。本文从研究人肺癌细胞热休克蛋白的表达情况出发,通过比较37℃、42℃和45℃培养条件下的人肺癌细胞A549总蛋白质的双向电泳图谱,获得3个温度敏感的差异蛋白点,依次命名为P1、P2、P3。对差异蛋白进行MALDI－TOF－MS分析和采用SWISS－PROT数据库中的Peptident软件检索后,初步鉴定P1与2种醛酮还原酶家族成员相匹配,P2可能为一种新蛋白,P3为锌指蛋白11A。     

人胚肺成纤维细胞与人肺腺癌细胞共同培养时的形态学变化

本文在混合培养的基础上建立了一种新的细胞培养技术。选用人肺腺癌细胞和人胚肺成纤维细胞,将两者按一定顺序定位培养在同一容器内的盖玻片上。在两种细胞相遇后,于不同时间取出长有细胞的盖片制成光镜和电镜标本。透射电镜标本采用了经过改进的原位包埋、水平切片法,使两种不同类型的细胞之间在定位培养时的超微结构变化得到充分显示。观察结果表明：两种细胞定位培养４天时,光镜观察未见明显的形态学改变,但电镜下已显示出变化;培养７天时,光镜及电镜观察均可见到与肿瘤细胞接触的成纤维细胞有损伤,与成纤维细胞接触的肿瘤细胞胞膜亦有破损。细胞化学染色显示肿瘤细胞周围的成纤维细胞内琥珀酸脱氢酶（ＳＤＨ）活性降低。     

天麻蛋白质的双向电泳和肽质量指纹谱分析与鉴定

采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谱技术对天麻染菌球茎皮层和不染菌的新生球茎皮层进行了比较蛋白质组分析与鉴定。双向电泳后在分子量 1 2～97kD、等电点 3～ 1 0范围内 ,每块胶分离到约 90 0个蛋白质点。对新生球茎中表达量明显增加的 5个蛋白质点用基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱 (MALDI TOFMS)进行肽质量指纹谱的分析 ,并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测 ,初步认为第 4号蛋白点是一个与转录有关的RNA结合蛋白。同时本文在天麻蛋白质组样品制备、数据库检索策略以及蛋白质鉴定成功率等方面进行了探讨。     

活细胞中丝裂霉素诱导肺腺癌细胞凋亡机理的分析

为了分析丝裂霉素(mitomycin C,MMC)引起的肺腺癌细胞(ASTC-a-1)凋亡,实验通过CCK-8试剂盒检测不同浓度MMC对ASTC-a-1活性的影响,选择10μgS/mL的MMC处理ASTC-a-1.利用Hochest 33258染色观察MMC引起的ASTC-a-1凋亡,发现MMC可引起细胞缩小,核浓缩.为了进一步研究MMC引起凋亡的途径,通过脂质体转染pSCAT3质粒,利用光漂白技术和光谱技术观察Caspase-3是否活化;通过转染Bax和DsRed质粒观察Bax在凋亡过程中的位置变化及与线粒体的关系.结果显示:MMC可以诱导ASTC-a-1细胞内Caspase-3活化,并使Bax向线粒体转移聚集.在活细胞中证实Caspase-3和Bax参与了MMC引起的ASTC-a-1凋亡.     

黄瓜悬浮细胞蛋白质组双向电泳分析技术

为建立适于黄瓜悬浮细胞蛋白质组分析的双向电泳体系,对黄瓜悬浮细胞蛋白质双向电泳分析所采用的胶条pH范围、样品制备方法、裂解液配方及分离胶浓度等参数进行研究。结果表明,采用pH范围为4～7的IPG胶条,直接裂解后丙酮沉淀法制备黄瓜悬浮细胞蛋白质,裂解液为8mol/L尿素、2mol/L硫脲、2%IPG Buffer、4%CHAPS、1%TBP、65mmol/L DTT、2mmol/L EDTA、0.001%溴酚蓝和1%鸡尾酒,分离胶浓度为11%,可获得蛋白质点分离清晰的双向电泳图谱。     

融合细胞株Eahy926与亲本人肺腺癌细胞株A549差异表达蛋白的蛋白质组学分析

融合细胞株Eahy926是人肺腺癌细胞株A549和人脐静脉内皮细胞杂交而成的永生化细胞株,具有血管内皮细胞的特性,已广泛用于内皮细胞相关研究. 本研究应用蛋白质组学技术分析融合细胞株Eahy926与亲本人肺腺癌细胞株A549的蛋白质差异表达,探讨融合细胞生物学特性变化及其机制. 对Eahy926和亲本A549的细胞总蛋白质进行双向凝胶电泳,在PDQuest软件辅助下找出差异表达蛋白质点,经肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF) 和串级质谱(tandem mass spectrometry,TMS) 分析,SWISS-PROT数据库检索,成功鉴定出28个差异蛋白,如CATB、CK8、CK18、annexin A2、GRP78、HSP90、HSP60、vimentin等一些与分子伴侣、氧化应激、能量代谢、信号转导等有关,并与肿瘤细胞分裂增殖、分化凋亡、侵袭转移、免疫逃逸以及肿瘤血管生长密切关联的蛋白质. 研究发现,融合细胞株Eahy926和人肺腺癌细胞株A549的蛋白质组表达谱存在明显差异,这将有助于今后进一步探讨肿瘤细胞与内皮细胞的相互作用机制及其融合细胞的特性,筛选肿瘤增殖和转移相关蛋白质及分子标志物,亦可为肿瘤的抗血管生成治疗提供新思路.     

无线粒体DNA的人肺腺癌A549细胞系的构建

目的:建立无线粒体DNA(mtDNA)的人肺腺癌ρ~0A549细胞系。方法:在含50 ng/mL溴化乙锭(EB)、100μg/mL丙酮酸钠和50μg/mL尿嘧啶核苷的RPMI1640细胞培养基中传代培养A549细胞;用低剂量EB连续诱导培养35 d后,采用光镜观察、TaqMan探针法实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹鉴定无mtDNA的ρ~0A549细胞系;采用MTT法测定ρ~0A549细胞增殖曲线。结果:倒置显微镜下野生型ρ^+A549细胞为多角形,ρ~0A549细胞形态呈拉长枝状;qPCR结果显示,低剂量EB诱导35 d的ρ~0A549细胞中无mtDNA的存在。Western印迹结果显示,ρ^+A549细胞中能表达核基因编码的线粒体蛋白SDHA和ATP5A,也能表达线粒体基因组编码的蛋白MT-COXI和MT-ATP6;ρ~0A549细胞中无MT-COXI和MT-ATP6蛋白表达,但核基因编码的SDHA和ATP5A蛋白能够正常表达。MTT结果显示,与ρ^+A549细胞相比,ρ~0A549细胞生长速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建和鉴定了无mtDNA的人肺腺癌ρ~0A549细胞系,为后续探讨mtDNA缺失或突变与人肺腺癌发生之间的关系奠定了实验基础。     

稳定表达p120ctn的人肺腺癌A549细胞株的构建

目的:构建稳定表达p120ctn的A549细胞株,以研究p120ctn蛋白在肺癌发生和转移过程中的作用。方法:通过分子克隆,将pc DNA3.1多克隆位点插入Flag标签的编码序列,得到pc DNA.Flag表达载体。然后PCR扩增p120ctn的编码序列,插入Flag标签下游,构建pc DNA.Flag-p120ctn质粒,筛选阳性克隆并进行酶切及测序鉴定。利用脂质体Lipofectamine 2000将pc DNA.Flag-p120ctn质粒转染到肺癌细胞A549中,通过G418筛选得到稳定转染细胞株,免疫印迹法检测p120ctn的表达。结果:本文构建了融合有Flag标签的p120ctn真核表达载体并转染到A549中,免疫印迹结果表明p120ctn蛋白在A549细胞中高效的表达。结论:本文成功构建了稳定高表达p120ctn的A549细胞模型,为深入研究p120ctn在肺癌的发生和转移过程中的作用奠定了基础。     

bFGF 诱导肺腺癌细胞系A549 上皮间质转化

目的:探讨上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程在肺癌侵袭转移中的作用。方法:体外培养A549细胞,以bFGF(10ng/ml)进行干预后,倒置相差显微镜观察细胞形态学变化;间接免疫荧光观察上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物vimentin蛋白表达的变化;采用细胞划痕试验检测bFGF对A549细胞迁移能力的影响;采用transwell小室试验检测bFGF对A549细胞侵袭能力的影响。结果:bFGF(10ng/ml)干预后,在倒置相差显微镜下观察,A549细胞形态变成了梭形,形态如同成纤维细胞。间接免疫荧光显示A549细胞E-cadherin表达随时间延长逐渐减弱,而vimentin表达逐渐增强。细胞划痕试验显示,bFGF干预后细胞迁移能力提高。Transwell小室试验显示,bFGF干预后细胞侵袭能力提高。结论:bFGF在体外诱导肺腺癌细胞系A549细胞发生上皮间质转化,上皮间质转化是肺癌侵袭转移的重要机制之一。     

不同转移能力的肺腺癌细胞系金属蛋白酶活性分析

为了探讨肺腺癌细胞系中金属蛋白酶的活性与其转移能力之间的相关性,选取9个转移能力不同的肺腺癌细胞系,分别对它们所分泌的金属蛋白酶MMP－2、MMP－9进行活性分析。结果发现,金属蛋白酶的活性与肺腺癌细胞系的转移能力有一定的相关性,其中MMP－9的活性与肺腺癌细胞系的转移相关性更显著。 Abstract:To investigate the relationship between the MMP activities and metastatic ability in human lung adenocarcinoma cell lines with differential metastatic potential.Nine lung adenocarcinoma cell lines were tested for their MMP activities by zymographic analysis methods.The MMP production capabilities of carcinoma cells rose following the increase of their metastatic potentials.The result suggested that there was some relationship between MMP－9 activties and metastatic potential in human lung adenocarcinomas.     

人原发性肺腺癌转移相关分子的定量蛋白质组学研究

癌细胞转移是人原发性肺腺癌(lung adenocarcinoma, AdC)死亡率高和预后差的主要原因．为了筛选潜在的肺腺癌转移相关分子标志物,依据临床诊断选取无转移的肺腺癌组织和有转移的肺腺癌组织作为研究对象,首先采用激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection, LCM)对两组肺腺癌组织中的癌细胞进行纯化,再利用荧光差异凝胶电泳技术(two-dimensional differential in-gel electrophoresis, 2D-DIGE)分离无转移肺腺癌组和有转移肺腺癌组的癌细胞总蛋白,通过Decyder软件分析两组差异表达的蛋白质点,质谱(mass spectrometry, MS)对差异表达的蛋白质点进行鉴定,Western blot验证部分差异蛋白annexin A1, annexin A2, annexin A3, B23和 S100A9的表达．建立了LCM 纯化的无转移和有转移的肺腺癌组织癌细胞的2D-DIGE图谱,质谱鉴定了20个非冗余差异蛋白质,其中12个蛋白质在有转移肺腺癌组中较无转移肺腺癌组表达上调,8个蛋白质在有转移肺腺癌组中表达下调．Western blot验证分析显示,差异蛋白annexin A1,annexin A2,annexin A3和 S100A9的表达水平在有转移肺腺癌中较无转移肺腺癌增高,B23的表达水平在有转移肺腺癌中较无转移肺腺癌降低．免疫组化进一步证实S100A9在有转移的肺腺癌中较无转移的肺腺癌中表达上调．首次应用LCM技术联合2D-DIGE及MS技术分析鉴定出肺腺癌转移相关蛋白质,为研究肺腺癌的转移分子机制、筛选预测肺腺癌转移的分子标志物奠定了基础．     

茶多酚联合反应停对人肺腺癌A549抑制作用研究

目的:观察茶多酚联合反应停对人肺腺癌生长的抑制作用;为研究茶多酚抗肿瘤血管生成提供依据。方法:人源肺腺癌(A549)细胞系经传代培养后,以BALB/c-nu裸鼠进行肿瘤移植,并以茶多酚,反应停及其联合用药进行干预性治疗,通过观察抑瘤率评价单用及联合用药对A549移植瘤生长抑制作用。结果:茶多酚、反应停及联合用药组的抑瘤率分别为33%、21.6%和35.9%,茶多酚、联合用药组与模型组相比有统计学意义(P<0.05);联合用药组与单用药组比,无统计学意义(P>0.05)。结论:茶多酚对A549生长有明显的抑制效果;反应停对A549的抑制作用需进一步观察;两者联合使用未见明显增效作用。     

Intracellular Free Calcium Concentration and Cisplatin Resistance in Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells

Human lung adenocarcinoma A₅₄₉ cells sensitive and A₅₄₉/DDP cells resistantto Cis-dichlorodiammine platinum[II] (cisplatin) exhibit differentintracellular free calcium and calcium fluorescence images labeled withFura-2/AM and Fluo-3/AM as judged by dual-excitation fluorescence assay,Miracal Imaging and Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) of singlecells. The concentration of intracellular free calcium of the resistantA₅₄₉/DDP cells is one third that of the sensitive A₅₄₉ cells. The effluxof Rhodamine 123 in resistant A₅₄₉/DDP cells is faster than that insensitive A₅₄₉ cells. In addition, A₅₄₉/DDP cells have an increase ofPhosphatidylinositol 4-kinase (PtdIns 4-kinase) activity in the plasmamembrane. So it is tentatively suggested that the increase in PtIns4-kinase activity resulting from lower intracellular Ca²⁺concentration leads to an increase of its enzymaticproducts——PIP and PIP₂, which may stimulate the activity ofP-glycoprotein.     

Pten^＋/＋MEFs与Pten^-/-MEFs细胞系的差异表达蛋白质组分析

目的：研究PTEN缺失细胞的蛋白表达规律。方法：用双向电泳技术比较Pten^＋/＋MEFs与Pten^-/-EFs细胞的蛋白表达差异;用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）对差异蛋白进行质谱分析;用肽质量指纹图谱检索数据库对差异蛋白进行鉴定;用Northern印迹和Western印迹验证蛋白的差异表达。结果：与Pten^＋/＋MEFs细胞相比。Pten^-/-MEFs细胞有明显的差异性蛋白表达谱,Pten^-/-MEFs细胞中表达下降的蛋白有铜锌超氧化物歧化酶、过氧化物氧化还原酶5和6等,表达增加的蛋白有低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶和丝切蛋白（cofflin）1。结论：PTEN的缺失引起细胞内多种蛋白表达改变,这些表达改变的蛋白可能与PTEN缺失后细胞癌变相关。