α-半乳糖苷酶酶解对猕猴红细胞结构功能的影响

目的　观察α 半乳糖苷酶对猕猴类人B抗原的酶解效果 ,探讨α 半乳糖苷酶酶解对猕猴红细胞结构、功能的影响。方法　采用热吸收放散试验从 30只华南猕猴中选取类人ABO血型抗原较强的 2只A型、3只B型猕猴做为实验对象 ,以基因重组的α 半乳糖苷酶体外酶解猕猴类人B型血抗原 ,并回输到A型猕猴体内 ,测定红细胞脆性、自身溶血率、胆固醇、高铁血红蛋白、乙酰胆碱脂酶、ATP等红细胞的结构功能指标。结果　经α 半乳糖苷酶酶解后 ,猕猴红细胞胞膜完整、携氧能力正常 ,酶解后的“通用”型血回输给受体猕猴无任何输血反应发生。结论　α 半乳糖苷酶酶解对于猕猴红细胞的形态、结构、功能无不良影响 ,且在实验动物体内是安全的。     

用于B→O血型改造的不同α-半乳糖苷酶的比较

α 半乳糖苷酶因可水解人B型红细胞表面的α 半乳糖残基 ,使B抗原结构变成O抗原结构 ,而成为B→O血型改造的工具酶 .对可能具有酶解B抗原活性的 3种α 半乳糖苷酶 ,即来源于大豆、咖啡豆和人的α 半乳糖苷酶的结构和功能进行了比较研究 .首先 ,利用序列分析工具对 3种酶蛋白的一级结构和特性进行了比较 ;随后 ,将编码大豆和人的α 半乳糖苷酶的cDNA克隆入毕赤酵母中进行表达 ,对筛选所得表达菌株进行诱导培养 ,并从培养上清中纯化重组的大豆和人α 半乳糖苷酶 ;分别测定大豆、咖啡豆和人α 半乳糖苷酶的生物化学性质以及它们的底物特异性 ;最后 ,以纯化的重组酶对人B型红细胞进行酶解 ,并测定酶解后红细胞的结构与功能 .结果表明 ,人源的α 半乳糖苷酶不适于酶解B抗原 ,而大豆来源的α 半乳糖苷酶不仅可作为B→O血型改造的工具酶 ,而且比咖啡豆来源的α 半乳糖苷酶更具优势     

基因工程α-半乳糖苷酶的制备及其性质研究

在获得可分泌表达α 半乳糖苷酶基因工程毕赤酵母菌株的基础上 ,尝试了基因工程α 半乳糖苷酶在 5L发酵罐中的表达以及从发酵液中纯化α 半乳糖苷酶的研究。在 4L无机盐培养基中接种 0 .4LpPIC9K Gal GS115培养物 ,最终得到 3 .5L发酵液。离心所得上清中总蛋白含量为 2 .1g L。根据发酵液中目的蛋白含量高、杂质少等特点 ,设计了如下的纯化流程 :离心→超滤→阳离子交换层析→脱盐→浓缩。纯化后电泳银染结果呈单一蛋白带 ,总回收率 41%。通过测定米氏常数等生化性质对重组酶进行鉴定后 ,完成了人B型红细胞的酶解实验。结果表明 ,从发酵液中纯化的α 半乳糖苷酶可将B型红细胞改造成O型红细胞。本研究同时在数量和质量上为α 半乳糖苷酶在众多领域的广泛应用奠定了基础。     

α-半乳糖苷酶

最近各种媒体不断报道红血球类型可以通过酶处理进行转换 ,这对于输血和开拓血源有十分重要的意义 ,所用的酶是α 半乳糖苷酶。α 半乳糖苷酶 (α ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ ,α Ｄ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅｇａｌａｃｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ ,ＥＣ 3.2 .1 .2 2 )能专一地催化α 半乳糖苷键的水解。它广泛存在于各种植物和动物体内 ,许多微生物如双歧杆菌 (Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ)、黑曲霉菌 (Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ) [1] 、大肠杆菌 (Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)Ｋ 1 2 1 [2 ]的抽提液中也发现有α 半乳糖苷酶的…     

B→O血型转变工具酶α-半乳糖苷酶cDNA克隆及表达

 α-半乳糖苷酶是实现 B→O血型转变、制备通用型血的关键工具酶 .利用反转录 PCR方法从中国海南 Catimor咖啡豆中克隆α-半乳糖苷酶 c DNA,插入嗜甲基酵母 P.pastoris分泌表达载体 p PIC9K中 ,转化 P.pastoris GS1 1 5,筛选高表达重组菌株 .经甲醇诱导表达 7d后 ,发酵液总蛋白分泌量约 1 .2 mg/ml,SDS- PAGE呈现约 41 k D特异表达带 ,与专一性底物对 -硝基 -苯基 -α- D-吡喃半乳糖苷反应证明 ,表达产物具有 α-半乳糖苷酶活性 ,最高达到 1 8U/ml.初步实验表明 ,表达的 α-半乳糖苷酶可酶解 B型红细胞 ,成功实现 B→O血型转变 .     

人α-半乳糖苷酶、α-1,2-岩藻糖转移酶cDNA序列转染克服异种移植超急性排斥反应

半乳糖α 1,3 半乳糖抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (hyperacuterejection ,HAR)的主要抗原 .α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以以不同的方式降低半乳糖α 1,3 半乳糖抗原在内皮细胞表面的表达量 .将人α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因单独或连接在一起导入猪血管内皮细胞PEDSV .15中 ,检测细胞表面的抗原及异种天然抗体对细胞杀伤作用 .结果表明α 半乳糖苷酶基因可以将猪血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原清除 74 13%,而α 1,2 岩藻糖转移酶基因也可以清除 4 7 75 %的细胞表面异种抗原 ,但二者都不能达到完全清除的目的 .当α 半乳糖苷酶和α 1,2 岩藻糖转移酶双基因在内皮细胞内共表达时 ,则可以基本清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 .抗原的减少也可以相应地减弱内皮细胞对异种天然抗体介导的杀伤作用的敏感性 ,尤其是双基因共表达时细胞基本不被杀伤 .结果表明 ,α 半乳糖苷酶基因和α 1,2 岩藻糖转移酶基因可以有效地清除血管内皮细胞表面的半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 ,克服HAR的发生 ,为下一步进行动物实验 ,探讨克服异种移植HAR提供了技术途径     

人α-半乳糖苷酶转导克服异种移植HAR的小鼠实验研究

α 半乳糖苷酶可以特异地清除半乳糖α 1,3 半乳糖抗原 (Galα1,3Galantigen) ,此抗原是引起异种器官移植超急性排斥反应 (HyperacuteRejection ,HAR)的主要异种抗原 .将构建好的α半乳糖苷酶转基因载体通过显微注射的方式注入小鼠受精卵 ,培育出了转基因小鼠 .结果表明 ,转基因小鼠的心、肝、肾、脾、肺组织中均有人α 半乳糖苷酶基因的表达 ,其表达可以有效减少小鼠器官表面Galα1,3Gal抗原的表达水平 ,可以降低转基因小鼠脾细胞对补体介导的杀伤作用的敏感性 .研究表明人源α半乳糖苷酶基因可用于研制不表达Galα1,3Gal抗原的转基因动物 ,从而可以降低异种器官移植HAR的反应强度 ,提高移植物的存活期     

一种来源于脆弱类杆菌的α-半乳糖苷酶的理化性质及其酶解B型红细胞的工艺研究

利用α-半乳糖苷酶去除红细胞表面的B抗原是制备通用O型红细胞的有效方法.本文在克隆表达纯化脆弱类杆菌来源的α-半乳糖苷酶的基础上对其理化性质进行了研究,该酶的分子量为64908Da,等电点在7.12～7.30之间,最适温度为41℃,最适pH为5.6～6.0,其理化性质适合用于B型红细胞的血型改造;为了确定高效、快速、温和的酶解条件,本文对酶解B型红细胞的工艺进行了优化.通过研究缓冲液对酶与红细胞结合的影响,确定了最佳酶解缓冲液为250mmol/L甘氨酸和3mmol/LNaCl,pH6.8;酶解的最适红细胞压积为40%,酶解温度为26℃,酶解时间为1h.利用优化的酶解工艺获得的B-ECORBCs形态及结构功能指标均正常,流式细胞结果证明其B抗原和H抗原标记率与O型红细胞相当,说明制备B-ECORBCs的工艺已成熟.这种工艺具有酶用量少、酶解条件温和、制备过程简单和时间短等优势,具有很好的临床应用前景.     

反义RNA对猪α-1,3-半乳糖苷转移酶活性的影响

 α 1,3 半乳糖表位是猪 人异种移植超急性排斥反应的主要抗原 ,由α 1,3 半乳糖苷转移酶催化合成 .用RT PCR方法扩增中国实验用小型猪α 1,3 半乳糖苷转移酶cDNA的前 582bp ,测定碱基序列并构建其反义表达载体pLXRN ,将其转染入猪主动脉内皮细胞 .NorthernBlotting表明α 1,3 半乳糖苷转移酶mRNA减少 .检测α 1,3 半乳糖苷转移酶活性表明 ,反义RNA可使其活性下降32 2 % .研究结果表明可能通过反义RNA来抑制猪 人异种移植超急性排斥反应     

酵母双杂交常用菌株AH109半乳糖苷酶检测实验呈阳性

α 及 β galactosidase(半乳糖苷酶 )是酵母双杂交实验中用来确定阳性相互作用的重要筛选标记 .理论上来说 ,只有同时携带有BD及AD载体 ,且BD载体上的诱饵蛋白 (Bait)与AD载体上的靶蛋白有相互作用时 ,才能激活酵母报告基因表达半乳糖苷酶 ,从而在LacZ实验中见到蓝斑 .另外 ,如果BD载体上的诱饵蛋白具自激活作用 ,那么只带有这一种质粒的酵母也会检测到半乳糖苷酶的活性 .所以 ,未转入任何质粒的 ,可用于酵母双杂交的菌株应该是检测不到半乳糖苷酶活性的 .但我们发现 ,本实验室未转任何质粒的AH10 9菌株 (2 0 0 2年购自Clontech ,Lo…     

酶解转变的人红细胞输注大鼠的实验研究

目的：利用大鼠评价酶解转变的人红细胞的安全性。方法：人红细胞与大鼠血清进行常规配血,检测二者之间的相容性;将人B型红细胞酶解后输注大鼠,流式细胞术检测人红细胞在大鼠体内的存活率。结果：人红细胞与大鼠血清不凝集,但人红细胞输注大鼠体内很快被排斥,1h下降至50％以下,18h被完全排斥。结论：仅依靠红细胞配血实验来选择人红细胞输血动物模型是不全面的,大鼠不适合作为酶解转变的人红细胞安全性评价的动物模型。     

Ia Restriction Specificity of KLH-Specific T Cells from Allogeneic Bone Marrow Chimeras Is Influenced by Histocompatibility at the H-2 and Minor Histocompatibility Loci

Ia restriction specificity involved in T cell proliferative responses to keyhole limpet hemocyanin (KLH) has been analyzed using a variety of allogeneic bone marrow chimeras. The chimeric mice were prepared by reconstituting irradiated AKR, SJL, B10.BR and B10.A(4R) mice with bone marrow cells from B10 mice. When such chimeric mice had first been primed with KLH in complete Freund's adjuvant (CFA), T cells from H-2 incompatible fully allogeneic chimeras showed significantly higher responses to KLH in the presence of antigen-presenting cells (APC) of donor strain (B10) than APC of recipient strain. However, in H-2 subregion compatible chimeras, [B10→B10.A(4R)], which were matched at the H-2D locus and at minor histocompatible loci, the T cells could mount vigorous responses to KLH with antigen-presenting cells (APC) of either donor or recipient type. The same results were obtained as well with chimeras that had been thymectomized after full reconstitution of lymphoid tissues by donor-derived cells. A considerable proportion of KLH-specific T cell hybridomas established from [B10→B10.A(4R)] chimeras exhibited both I-A^b and I-A^k restriction specificities. The present findings indicate that the bias to donor Ia type of antigen specific T cells is determined by donor-derived APC present in the extrathymic environment but that cross-reactivity to the recipient Ia is influenced to some degree by histocompatibility between donor and recipient mice, even though the histocompatible H-2D locus and minor histocompatibility loci seem not to be directly involved in the I-A restricted responses studied herein.     

甲氧基聚乙二醇(mPEG)修饰遮蔽人ABO血型抗原

输血是一种非常有效的临床治疗手段 ,但血型不符会造成输血死亡事故 .为了解决输血中存在的血型匹配困难等问题 ,使用甲氧基聚乙二醇 (mPEG)化学修饰法 ,对红细胞表面的血型抗原进行化学修饰 ,从而达到遮蔽红细胞血型抗原的目的 .通过对mPEG BTC、mPEG ALD和mPEG 2 NHS三种mPEG衍生物对红细胞A抗原和B抗原修饰效果的比较 ,结果表明mPEG BTC修饰效果最好 ,可以完全遮蔽红细胞的A抗原和B抗原 ,使修饰后的A型、B型和AB型红细胞呈现出与O型红细胞相同的血型血清学特征 ;进一步研究证明 ,mPEG BTC与红细胞结合牢固 ,对红细胞结构、功能、变形能力、常规指标和沉降率等基本没有影响 .初步实现了A→O ,B→O和AB→O的血型改造 ,从而为临床输血治疗遇到的偏型、稀有血型、配型困难等问题的解决 ,提供了新的技术方法与思路 .     

体外化学修饰红细胞--通用型血?

目前国内外对通用型血的研究主要是改造修饰红细胞表面抗原。研制的方法有两种：体外酶解修饰人A、B抗原制备O型血和使用化学材料甲氧基聚乙二醇(mPEG)共价结合到红细胞表面,遮蔽血型抗原。两种修饰的结果均表明对红细胞的结构、功能无影响。这两种修饰方法为制备通用型血供临床输血开拓了崭新的途径,具有重要意义。     

Cloning,Expression, and Characterization of Rice α-Galactosidase

We have successfully cloned an α-galactosidase gene from a rice cDNA library and transformed it into Escherichia coli BL21. It was subsequently cloned to the pPIC9K vector and expressed in Pichia pastoris. A selected clone was found to result in high production yield of the galactosidase enzyme. The secreted enzyme was purified, and it revealed as a major protein band on an SDS-PAGE gel. The optimal pH value, enzyme stabilities, and substrate specificity were studied. The enzyme specificity toward the terminal α1→6, 1→4, and 1→3 linked galactosyl residue from various substrates was investigated. By determining the Michelis constant (Km) of the enzyme for melibiose, raffinose, and stachyose, our results showed that melibiose was hydrolyzed faster than raffinose, whereas the published data reported a reversed sequence, raffinose > melibiose. The enzyme also showed the ability of converting B red blood cells into O red cells. The objective of this work is to develop the Pichia system to produce a large quantity of enzyme for blood cell conversion for transfusion.     

Induction of linked suppression in addition to the donor H-2 class I-specific unresponsiveness in recipient T cells by transfusing class I plus class II-disparate, but not class I alone-disparate, bone marrow cells

This study was undertaken to determine whether bone marrow (BM) cells contain a cell population with the capacity to induce an unresponsiveness of T cells specific to the BM self-H-2 class I antigens in vivo, i.e., veto cell population. Recombinant or congenic mice were infused intravenously with H-2-incompatible BM cells. One to several weeks later, donor H-2-and irrelevant H-2-specific responses in mixed lymphocyte reaction cultures of recipient T cells were assessed. Transfusion of H-2-incompatible BM of C57BL/10 (B10) recombinant strains caused a long-lasting cytotoxic T lymphocyte (CTL) unresponsiveness to the donor class I antigens in recipient lymph node cells. When class I plus class II-disparate BM cells were transfused, an anti-donor class I CTL response and a response against a third-party class I antigen, which was presented on the stimulator cells coexpressing the donor class I and class II, were significantly suppressed. This linked suppression lasted for less than 2 weeks after transfusion. Transfusion of class I-alone-disparate BM induced the donor class I-specific CTL unresponsiveness, but not the linked suppression. The induction of linked suppression was prevented considerably by transfusing nylon wool-nonadherent BM or by treating recipients with cyclophosphamide 2 days before transfusion. An anti-third-party class I CTL response, stimulated in vitro with fully allogeneic spleen cells, was not hampered by the BM transfusion. Coculturing the lymph node (LN) cells obtained from the class I plus class II-disparate BM recipient with normal LN cells interfered with the generation of both anti-donor class I and anti-linked third-party class I CTL, whereas, coculturing LN cells from the class I alone-disparate BM recipient inhibited neither specificity of CTL generation. Transfusion of class I plus class II-disparate BM resulted in a significant suppression of the donor class II-specific proliferative response. In contrast, transfusion of class I alone-disparate BM did not suppress any proliferative responses, including even a "linked" third-party class II-specific response. Transfusion of bm 1, (B6 X bm 1)F1, or (bm 1 X bm 12)F1 BM to B6 did not induce unresponsiveness in bm 1-specific CTL responses. However, the transfusion resulted in a significant suppression of bm 1-reactive proliferative response of recipient LN cells.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)