重组新城疫病毒Anhinga株与TRAIL蛋白协同杀伤肿瘤细胞

将新城疫病毒（Newscastle disease virus, NDV）Anhinga株的全 长基因组cDNA克隆质粒、pTM1-L、pTM1-P、pTM1-NP表达质粒共转染稳定表 达T7 RNA聚合酶的BSRT7/5细胞,得到拯救NDV病毒．通过PCR、酶切法、测 序证明拯救病毒中存在引入的分子标签.通过血凝实验、蚀斑测定证明成功 拯救病毒.并研究了该重组病毒对4种不同人肿瘤细胞的体外杀伤效果．首 次证明重组Anhinga株对SMMC-7721细胞、A549细胞、HepG2细胞和SH-SY5Y 细胞均有杀伤作用．该重组病毒主要诱导SMMC-7721细胞和A549细胞凋亡, 诱导HepG2细胞和SH-SY5Y细胞坏死．TNF家族成员TRAIL蛋白可以显著增强 NDV杀伤肿瘤细胞的效果.本实验为进一步研究重组NDV用于肿瘤治疗奠定基 础．     

Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力及E-cadherin，COX-2表达的影响

目的:探讨Notch信号通路对肝癌细胞迁移能力及钙粘附蛋白E(E-cadherin)、环氧化酶-2(COX-2)表达的影响。方法:体外培养肝癌细胞系(SMMC-7721、MHCC97H)、正常非肿瘤肝细胞系(HL-7702),Transwell小室用于测定细胞的迁移侵袭能力,Western blot蛋白印迹法用于测定Notch1、E-cadherin、COX-2蛋白的表达水平,并采用DAPT阻断Notch信号通路,比较肝癌细胞系与正常非肿瘤肝细胞系的迁移侵袭能力及肝癌细胞中E-cadherin、COX-2蛋白的表达水平的改变。结果:SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞的迁移能力强于HL-7702细胞,差异有统计学意义(P0.05);相比于HL-7702细胞,MHCC97H细胞、SMMC-7721细胞中的Notch1、COX-2表达水平均显著升高,E-cadherin的表达水平明显降低(P0.05);DAPT处理后,SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞发生迁移的能力均弱于对照组,差异有统计意义(P0.05);DAPT处理后,SMMC-7721细胞、MHCC97H细胞内COX-2、Notch1的表达量明显降低,而E-cadherin的表达水平升高(P0.05)。结论:Notch信号通路参与肝癌细胞迁移过程,其机制可能与E-cadherin、COX-2的表达相关。     

shRNA沉默HuR抑制肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移及侵袭能力

人抗原R (human antigen R,HuR)基因在肺癌、乳腺癌等多种肿瘤组织中高表达。推测HuR基因也参与肝癌的发展过程。为探索HuR对肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移和侵袭的作用,本研究通过蛋白质印迹实验,检测HuR在肝细胞癌细胞系和正常肝细胞中蛋白质的表达水平。结果显示,肝细胞癌细胞系SMMC-7721 HuR的表达量显著高于正常肝细胞HL-7702。合成特异性靶向HuR基因的shRNA,转染肝细胞癌细胞系SMMC-7721,检测结果发现,HuR基因表达量下调90%。沉默HuR,实时细胞分析技术(real time cell analysis,RTCA)结果显示,细胞增殖能力降低55%,侵袭能力下降75%;细胞划痕实验结果显示,迁移能力下降80%;克隆形成实验中细胞克隆数减少85%;此外,在HuR敲低稳转肝细胞癌细胞系SMMC-7721细胞中过表达Bcl-2,其细胞学现象部分获得逆转。激光共聚焦扫描系统检测结果显示,Bcl-2主要定位于肝细胞癌细胞系SMMC-7721的核膜及胞质。蛋白质印迹法检测结果显示,沉默HuR,Bcl-2下调92%,Survivin下调55%,Twinst1下调69%,N-钙黏着蛋白(N-cadherin)下调48%,E-钙黏着蛋白(E-cadherin)上调1.5倍。以上结果表明,HuR可能通过调控定位于核膜及胞质上的Bcl-2来参与肝细胞癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移、侵袭及克隆形成过程,HuR基因有望成为临床上治疗肝癌的一个新的潜在靶点。     

RMP在肝癌细胞基因组稳定性和凋亡中的作用

目的:研究RPB5调节蛋白(RMP)在正常肝细胞及肝癌细胞基因组稳定性中的作用,并探讨其与细胞凋亡的相关性。方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从mRNA 水平检测正常细胞系及多种肿瘤细胞系中RMP的表达。不同剂量⁶⁰Coγ射线照射肝癌细胞SMMC-7721细胞和正常肝细胞HL-7702细胞,RT-PCR法检测RMP的表达,流式细胞技术检测照射肝癌细胞周期变化及细胞凋亡。应用RNA干扰技术研究RMP在肝癌细胞基因组稳定性中的作用。结果:正常细胞系及多种肿瘤细胞系中RMP基因均有不同程度的表达。经⁶⁰Coγ射线诱导的肝癌细胞及正常肝细胞RMP表达水平明显升高,且有一定剂量依赖性。随着照射剂量增加细胞凋亡明显增多,细胞周期G₁期增高,而S期明显降低。RMP被干扰后, 电子显微镜观察细胞形态发生明显改变,p21基因表达减弱。结论:RMP具有维持细胞基因组稳定性的潜在作用。RMP的表达与p53、p21等具有一定相关性,可能与后者协同调节细胞凋亡过程。     

CHOP在三氧化二砷诱导SMMC-7721 凋亡中的作用

目的:探讨CHOP在三氧化二砷(Arsenic Trioxide,As_2O_3)诱导肝癌细胞系SMMC-7721凋亡中的作用。方法:通过MTT法观察不同浓度的As_2O_3对肝癌细胞系SMMC-7721增殖活性的影响;通过流式细胞术检测不同浓度的As_2O_3作用后,SMMC-7721细胞的凋亡率;以Western-blot方法检测As_2O_3处理SMMC-7721细胞后,内质网应激相关蛋白GRP78,CHOP的变化。通过CHOP siRNA沉默CHOP后,观察As_2O_3对SMMC-7721细胞凋亡的影响。结果:As_2O_3能显著抑制SMMC-7721细胞的增殖活性,并呈剂量依赖性诱导SMMC-7721细胞的凋亡;Western blot结果显示三氧化二砷诱导内质网应激相关蛋白的表达。CHOP siRNA沉默CHOP后能够显著抑制As_2O_3对SMMC-7721细胞凋亡的诱导。结论:As_2O_3诱导SMMC-7721细胞凋亡可能与其诱导CHOP表达有关。     

EPA诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡及端粒酶活性调控机制研究

目的:探究二十碳五烯酸(Eicosa Pentaenoic Acid.EPA)对SMMC-7721人肝癌细胞的凋亡、端粒逆转录酶h TERT的调控作用及端粒酶表达活性的影响。方法:体外培养SMMC-7721人肝癌细胞,用不同浓度的EPA(0μM、25μM、50μM、100μM、200μM)作用于SMMC-7721肝癌细胞(24 h、48 h、72 h)后,显微镜下观察其形态学变化;应用MTT法检测SMMC-7721肝癌细胞细胞增殖变化情况;Western-blot法检测h TERT、Bax、Bcl-2蛋白表达水平变化;Real Time-PCR检测h TERTm RNA的表达变化;ELISA法检测SMMC-7721肝癌细胞端粒酶活性的表达水平。结果:EPA可诱导肝癌细胞SMMC-7721发生细胞凋亡,具有明显的时间计量依赖关系。在此过程中Bcl-2蛋白表达的降低和Bax蛋白表达上调,同时端粒酶逆转录酶h TERT蛋白及其m RNA的表达水平和端粒酶活性均明显降低。结论:抑制端粒酶逆转录酶基因(h TERTm RNA)表达而抑制端粒酶的活性、诱导癌细胞凋亡,可能是EPA的抗癌作用机制之一。     

PHA-767491联合TRAIL抑制肝癌细胞Bel-7404增殖

将小分子抗癌药物PHA-767491和携带TRAIL基因的非复制型腺病毒(Ad-TRAIL)共同作用于肝癌细胞Bel-7404,探讨PHA-767491联合TRAIL蛋白对肝癌细胞增殖的协同抑制作用及其作用机理. MTT法检测细胞存活率,Hoechst 33342荧光检测细胞凋亡现象和流式细胞仪检测细胞凋亡水平. 结果表明,PHA-767491联合Ad-TRAIL抑制Bel-7404细胞增殖的能力显著优于单一用药. Western印迹进一步分析蛋白表达水平显示,PHA-767491可以通过下调抗凋亡蛋白Mcl-1和Xiap的表达,从而显著增强TRAIL蛋白诱导Bel-7404细胞凋亡的能力;PHA-767491联合Ad-TRAIL处理Bel-7404细胞后,不仅Bel-7404细胞凋亡水平显著增加,并且伴随着PARP和Caspase3的大量剪切. 本研究证实, PHA-767491和TRAIL的联合使用对抑制肝癌细胞Bel-7404增殖表现出了显著的协同效应,为今后癌症药物的联合治疗提供了新的思路.     

壳寡糖对肝癌细胞SMMC-7721中Bcl-2和Caspase-3表达的影响

目的检测壳寡糖对人肝癌SMMC-7721细胞的抑制效果及对凋亡调控蛋白Bcl-2和Caspase-3的影响。方法采用噻唑蓝（MTT）法检测不同浓度壳寡糖对肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖的抑制作用,并利用荧光Hoechst33258染色法检测细胞凋亡状况。最后通过免疫细胞化学方法研究壳寡糖对肝癌细胞SMMC-7721中Bcl-2和Caspase-3表达的影响。结果壳寡糖能够抑制SMMC-7721细胞增殖,并且促进SMMC-7721细胞的凋亡,并且壳寡糖能够上调促凋亡蛋白Caspase-3的表达和降低抑制凋亡蛋白Bcl-2的表达。结论壳寡糖对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖有抑制作用,此作用可能是通过促进Caspase-3的表达和抑制Bcl-2的表达来实现的。     

姜黄素通过MAPK信号通路诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡

本文阐述了姜黄素(Curcumin)对体外培养的人肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响,并探讨了其诱导凋亡的信号转导机制。采用MTT法和细胞计数法检测不同浓度姜黄素对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖的影响,利用流式细胞术检测姜黄素对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的影响,通过RT-PCR及Western blot检测姜黄素对人肝癌SMMC-7721细胞中凋亡相关蛋白Caspase-3、Survivin、Bcl-2和Bax表达的影响,最后通过检测MAPK的磷酸化水平分析姜黄素诱导SMMC-7721细胞凋亡的信号转导机制,通过MAPK抑制剂实验进一步证实诱导凋亡的分子机制。研究结果显示,姜黄素呈时间和剂量依赖性抑制人肝癌SMMC-7721细胞的增殖,其中40μmol/L姜黄素可明显诱导SMMC-7721细胞的凋亡,并呈时间依赖性上调促凋亡蛋白Caspase-3和Bax的表达、下调抗凋亡蛋白Survivin和Bcl-2的表达,姜黄素对凋亡相关蛋白表达的调节及诱导凋亡可以通过激活JNK、抑制ERK和p38 MAPK信号通路实现。表明姜黄素可诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡,其机制与姜黄素激活JNK、抑制ERK和p38 MAPK信号通路从而上调Caspase-3和Bax的表达,下调Survivin和Bcl-2的表达有关。