人胚胎干细胞向滋养层分化的研究进展

哺乳动物胚胎发育产生的第一个细胞系的分离是内细胞团和滋养层的分离,不同哺乳动物之间胚胎干细胞向滋养层细胞分化不同,滋养层细胞对胚胎的植入、促进胚胎在子宫内的生存和生长至关重要.人胚胎干细胞为研究人类胚胎发育及向滋养层分化提供了一个独特的模型.人胚胎干细胞可以在实验室条件下保持无限期稳定的培养,用于最初胚胎和滋养外胚层发生的机制研究.目前人胚胎干细胞分化为滋养层细胞在体外可以通过自发分化、基因敲除、分离EB小体和BMP4诱导等几种途径实现.不同哺乳动物之间胚胎干细胞向滋养层分化机制,主要通过信号通路如BMP4,LIF等以及某些标志基因如OCT4,CDX2,Eomes等的变化调节.人胚胎干细胞向滋养层分化的研究为临床应用提供了一定的基础.     

一种新的培养人胚胎干细胞的包被基质

目的开发一种新的培养人胚胎干细胞(hESCs)的包被基质,使hESCs的培养更加简便。方法用甲醇固定的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)作为包被基质,人胚胎干细胞系X-01在该基质上生长,每隔5~6 d传代一次,培养10代后,对人胚胎干细胞特性进行检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达和分化能力。结果 hESCs在新的基质上生长良好,经10次传代后仍能保持典型的hESCs克隆形态。碱性磷酸酶染色阳性,免疫荧光染色Oct4、SSEA4、Tra-1-60为阳性,体外分化可形成拟胚体。结论此种固定的基质可以大量制备,长期保存,并可以长期维持hESCs的未分化状态,为人胚胎干细胞的体外扩增探索出了一个新的途径。     

昆明小鼠胚胎干细胞滋养层制备条件的实验研究

目的:建立小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)滋养层,用于昆明小鼠胚胎干细胞的培养。方法:取妊娠13.5的胎鼠,采用组织消化法分离培养出原代成纤维细胞,对MEFs的生长形态、生长曲线及分裂指数进行观察;MTT法筛选丝裂霉素C(MMC)作用的最佳浓度和时间;取妊娠3.5d的囊胚在经MMC处理的饲养层上培养,观察胚胎干细胞集落生成情况。结果:MEFS为一种贴壁生长且增殖速度较快的细胞,第三代细胞增殖旺盛,第5代以后细胞开始变形并趋于衰老;MMC能抑制胚胎成纤维细胞的增殖,最佳的作用浓度和时间是10ug/ml作用2.5～4h,20ug/ml作用1-2.5h。妊娠3.5d小鼠囊胚在饲养层上培养能形成典型的"鸟巢"状干细胞集落,并可维持胚胎干细胞的正常形态且不发生分化。结论:这种方法制备的滋养细胞层适用于胚胎干细胞的培养。     

潮霉素抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层的制备

目的：获得潮霉素抗性的小鼠胚胎干细胞滋养层。方法：利用基因组整合了潮霉素B磷酸转移酶基因的小鼠品系Smad4hygro＋/-,从受精14d的小鼠胚胎中制备原代胚胎成纤维细胞;鉴定基因型后,挑选一株潮霉素B磷酸转移酶基因杂合型胚胎成纤维细胞,用丝裂霉素C处理,以获得潮霉素抗性的滋养层细胞。结果：经潮霉素B加压处理后,杂合型滋养层细胞可存活2周左右,并可维持胚胎干细胞的生长。结论：制备的滋养层细胞可用于潮霉素抗性胚胎干细胞的筛选。     

一种新的人胚胎干细胞无饲养层培养方法的建立

目的:以转染碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胎肝基质细胞株(FLSC)培养人胚胎干细胞(hESC),寻找更加安全、有效的体外培养扩增方法。方法:通过ELISA方法定量检测转基因的人FLSC条件培养基中bFGF的分泌量;以商业化的mTeSR1无血清无饲养层培养基、常规小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)条件培养基,以及转染bFGF的人FLSC条件培养基(bFGF/FLSC-CM)分别培养扩增H9细胞。通过观察hESC形态、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR,检测hESC全能性标志物的表达。结果:ELISA方法检测bFGF/FLSC-CM中bFGF因子的分泌量为(770.09±17.28)pg/mL,而MEF-CM中bFGF因子的分泌量为(55.59±0.61)pg/mL,两者存在显著差异(P0.01);在3种培养体系下,免疫荧光检测hESC全能性标志Oct-4、Tra-1-81抗体的表达均呈阳性,流式检测细胞表面阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)抗体阳性细胞的比例均在99%左右;RT-PCR检测到hESC特异的转录因子Oct-4、Nanog、Sox-2的表达。结论:以转染bFGF的人FLSC条件培养基可以有效扩增hESC,可为临床应用提供一种安全、高效、低成本的无饲养层培养方法。     

一种体外快速分离脂肪来源干细胞的方法

目的:以小鼠为模型,建立一种基于流式细胞仪为检测手段的快速分离脂肪来源干细胞的方法,解决间充质干细胞进入实际应用过程中遇到的难题。方法:取BALB/c小鼠腹股沟内侧的皮下脂肪组织,采用Ⅰ型胶原酶消化等系列措施,获取脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)。所得细胞分离培养4代后,流式细胞仪分选出CD73+CD45-ADSCs后成骨诱导分化。碱性磷酸酶染色和实时荧光定量PCR检测其分化情况。结果:刚分离培养的ADSCs细胞普遍呈圆形或椭圆形,传至第三代的细胞,非MSCs细胞逐渐被淘汰,剩余的细胞形态逐渐变得一致,细胞形态呈梭形。流式细胞仪检测发现ADSCs细胞表面抗原标记CD73+CD45-为20.7%。所得的ADSCs成骨诱导分化后碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色呈阳性,实时荧光定量PCR检测成骨标志基因发现它们表达上调,其中ALP的表达高达22倍。结论:本方法可以获得纯度较高的ADSCs,且耗时少成本低;且提示可采用该方法来获得大量的人源ADSCs用于组织工程修复。     

从人胚胎干细胞畸胎瘤中有效获取间充质干细胞和神经前体细胞

通过人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESC)体外分化方法和畸胎瘤形成可以分化获得多种成体细胞．但目前尚不清楚是否可以从hESCs畸胎瘤中分离某些特异性细胞．通过体外筛选方法,有效地从hESCs畸胎瘤中分离出神经前体细胞(neural progenitor cells,NPCs)和间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)．这种hESCs畸胎瘤来源的NPCs和MSCs与体内神经前体细胞和间充质干细胞有着相似的分子标记和特性,并具有进一步的分化潜能——分别可以诱导成为神经元、神经胶质细胞、脂肪细胞和骨骼细胞等．根据人胚胎干细胞畸胎瘤中含有不同分化阶段的外胚层、中胚层和内胚层的组织或细胞,认为人胚胎干细胞畸胎瘤可以作为另一个细胞来源以获取多种(包括人胚胎干细胞体外分化难以得到的)各种前体/干细胞和终末分化细胞．     

人脐带间充质干细胞作为维持人胚胎干细胞生长饲养层细胞的研究

目的寻找可以维持人胚胎干细胞未分化生长的人源性细胞作为饲养层细胞,从而解决使用鼠源性细胞作为饲养层带来的安全问题。方法尝试以人脐带间充质干细胞作为饲养层细胞来培养人胚胎干细胞,检验其是否可以维持人胚胎干细胞的未分化生长状态。用胶原酶消化法分离人脐带间充质干细胞,光镜下观察细胞形态;流式细胞仪检测其表面标志;诱导人脐带间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞进行分化。将人胚胎干细胞系H1接种于丝裂霉素C灭活后的人脐带间充质干细胞上,每隔5d进行一次传代。培养20代后,对人胚胎干细胞特性进行相关检测,包括细胞形态、碱性磷酸酶染色、相关多能性基因的表达、分化能力。结果从人脐带中分离出的间充质干细胞为梭形,呈平行排列生长或漩涡状生长;细胞高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90、CD86、CD147、CD117,不表达CD14、CD38、CD133、CD34、CD45、HLA-DR;具有分化成脂肪细胞和成骨细胞的潜能。人胚胎干细胞在人脐带间充质干细胞饲养层上培养20代后,继续保持人胚胎干细胞的典型形态,碱性磷酸酶染色为阳性,免疫荧光染色显示OCT4、Nanog、SSEA4、TRA-1-81、TRA-1-60的表达为阳性,SSEA1表达为阴性,体外悬浮培养可以形成拟胚体。结论人脐带间充质干细胞可以作为人胚胎干细胞的饲养层细胞,支持其生长,并维持其未分化生长状态。     

人胚胎干细胞的体外定向分化

人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）由囊胚期胚胎内细胞团分离培养获得,具有保持未分化状态的无限增殖能力。hESCs具有多向分化潜能,在体内和体外均可分化形成所有三个胚层（外胚层、中胚层、内胚层）的衍生物。hESCs一般在鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblast,MEF）饲养层上培养和扩增。为了优化培养条件,目前人们已发展了多种人类细胞饲养层和无饲养层、非条件培养基体系。hESCs可以在体外定向诱导分化为多种细胞类型,为揭示人胚早期发育机制和发展多种疾病的细胞移植治疗奠定了基础。hESCs可以在体外进行遗传修饰,将有助于揭示特定基因在发育过程中的调控和功能。对hESCs的深入研究将极大地推动医学和生命科学的进展,并将最终应用于临床,造福人类。     

用于胚胎干细胞分离培养的滋养层细胞株的建立

具有发育全能性的胚干细胞在分离培养时必须依赖滋养层细胞~［１］,本研究旨在建议一个可供使用的滋养层细胞株。将小鼠胎仔去头、内脏、四肢后用胰酶消化,用作成纤维细胞的初代培养,２～３６后继代培养,并开始进行选择和株化,获得的继代培养的成纤维细胞可用于制备胚干细胞培养所需滋养层,亦可冷冻保存备用。本实验所建立的小鼠成纤维细胞系,已成功地用于胚干细胞的分离培养,证明可作为分离培养胚干细胞时所需的滋养层细胞来源。