小麦条锈菌II类几丁质合成酶基因PstChsII的克隆及表达特征

摘要:【目的】克隆小麦条锈菌几丁质合成酶基因PstChsII,分析其在小麦条锈菌不同发育时期的表达水平。【方法】利用RT-PCR和PCR技术克隆PstChsII的cDNA序列和基因组序列,利用不同的生物信息学软件对序列进行分析,运用实时荧光定量技术分析基因在孢子、芽管以及不同侵染时间的表达水平。【结果】PstChsII基因（Genbank登录号GQ329851）编码区存在15个内含子,开放阅读框长2727 bp,编码908个氨基酸。PstChsII蛋白C端含有7个跨膜螺旋区,N端含多个保守结构域和“QXR     

棉铃虫HaKettin1基因的全长cDNA克隆、序列分析和表达谱

【目的】为了克隆棉铃虫Helicoverpa armigera编码肌肉蛋白Kettin基因的全长cDNA序列以及鉴定该基因在棉铃虫发育周期内的表达模式。【方法】利用兼并引物,通过分段RT-PCR和5′-和3′-RACE的方法克隆全长cDNA序列。利用半定量RT-PCR进行表达谱分析。【结果】编码棉铃虫Kettin蛋白的基因HaKettin1全长cDNA序列为13 805 bp,包含一个13 365 bp的开放阅读框,编码4 454个氨基酸,蛋白分子量约为504.3 kD。组织表达结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个生育周期都有表达,幼虫期的表达尤为显著。【结论】HaKettin1与家蚕的Kettin蛋白具有90％的同源性,表明鳞翅目昆虫的Kettin蛋白之间具有很高的保守性。表达谱结果显示HaKettin1基因在棉铃虫的整个发育过程中都发挥重要作用。     

大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因的克隆与表达分析

【目的】储存蛋白是昆虫发育、变态和生殖过程中氨基酸的主要来源,Hexamerin是储存蛋白家族重要成员,在昆虫的生长发育中起着重要作用。为了研究hexamerin基因(SpbHex)在大豆食心虫Leguminivora glycinivorella Matsumurav生长发育过程中的作用,对大豆食心虫SpbHex基因进行克隆与表达分析。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆SpbHex的cDNA全长序列,并通过qPCR研究其在不同发育阶段和幼虫不同组织的表达情况。【结果】SpbHex基因cDNA序列全长2 161 bp,其中开放阅读框2 112 bp,编码703个氨基酸。蛋白预测分子量84.15 ku。hexamerin基因在大豆食心虫不同发育阶段和不同组织中均有表达。在不同生长发育阶段中4龄幼虫的表达量较高,1龄和成虫的表达量较低;在不同组织中脂肪体的表达量较高,表皮中的表达量最低。【结论】本研究克隆了大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因,并对其在大豆食心虫中表达模式进行分析,为进一步明确hexamerin基因在大豆食心虫生长发育中的作用奠定基础。     

家蚕雌激素相关受体基因的克隆与表达分析

【目的】黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 雌激素相关受体（estrogen-related receptor, ERR）通过调节糖酵解过程进而控制果蝇的能量代谢。本研究在克隆家蚕Bombyx mori ERR 基因 (BmERR) 的基础上,对其分子特性和系统演化进行生物信息学分析, 并检测该基因在家蚕生殖腺中的表达,为进一步研究ERR功能奠定基础。【方法】采用PCR技术克隆 BmERR 基因的全长cDNA序列,进行生物信息学分析;利用半定量RT-PCR检测该基因在停食后家蚕幼虫生殖腺中的表达情况。【结果】BmERR 基因全长cDNA序列为1 296 bp,编码431个氨基酸残基;具有ERR蛋白家族典型的结构特征;系统进化分析显示BmERR与其他昆虫ERR氨基酸序列一致性较高;半定量 RT-PCR 检测表明,BmERR 在家蚕上簇到化蛾期间的精巢和卵巢中均有表达,表达具有时期特异性,化蛹第1天达到表达高峰。【结论】本研究首次从鳞翅目昆虫中克隆获得ERR cDNA序列。ERR基因在家蚕生殖腺中表达量无明显性别差异,但具有发育时期特异性。     

草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的克隆及异源表达

【目的】克隆草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA,证实其编码的蛋白具有漆酶活性,最终建立草菇漆酶基因的异源表达及纯化体系。【方法】利用RACE技术克隆全长cDNA序列,并利用生物信息学技术进行序列分析,在此基础上,去除全长cDNA的编码信号肽的序列并在3'端添加His-tag碱基序列,把修饰后的cDNA片段克隆到表达载体pPIC9K上,并转化到毕赤酵母GS115中进行表达,对重组蛋白利用Ni柱进行分离纯化并以ABTS底物法检测重组蛋白的漆酶活性。【结果】vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA的长度分别为1599 bp和1554 bp,且分别含有19和15个外显子;其编码的蛋白的理论分子量分别是57.3 kDa和56.3 kDa,理论等电点分别为4.73和5.62,且都属于分泌型的胞外蛋白;表达出的重组蛋白RBvvlac1和RBvvlac6,其分子量大小约为70 kDa,说明存在翻译后修饰;含有150 mmol/L咪唑的缓冲液对RBvvlac1和RBvvlac6发酵液进行洗脱所得到的蛋白溶液具有最高漆酶活性(333.17 U/L和227.63 U/L)。【结论】草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6能够编码有活性的漆酶蛋白,本研究建立的异源表达及纯化体系适用于草菇或其它漆酶基因的异源表达与纯化。     

棉铃虫HaTO-like基因的克隆、序列分析和表达特征

【目的】克隆和分析了棉铃虫Helicoverpa armigera HaTO-like基因的编码框序列,检测了该基因的时空表达谱以及在棉铃虫感染核型多角体病毒HaSNPV后的转录变化,为深入研究该基因的功能提供理论依据。【方法】本研究利用RT-PCR的方法首次克隆获得HaTO-like基因的全长cDNA序列,通过几种生物信息学软件对该基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析,并利用荧光定量PCR技术检测了该基因在棉铃虫不同发育阶段、幼虫组织和成虫组织的表达情况,以及HaSNPV感染对HaTO-like基因表达的影响。【结果】棉铃虫HaTO-like基因cDNA全长为994 bp,开放阅读框为756 bp,编码251个氨基酸,其蛋白序列的N端含有23个氨基酸的信号肽。进一步的序列分析表明棉铃虫HaTO-like与其他昆虫同源蛋白的氨基酸序列一致性不是太高,大概在39%~61%之间,其中与家蚕和脐橙螟在系统进化上关系最近。荧光定量PCR结果表明该基因在棉铃虫的5龄0 h和成虫第1天的的表达量相对较高,在幼虫的头部和表皮内的表达量较其他幼虫组织较高,在成虫的头部和足的表达量也相对较高。而病毒感染则显著地诱导了该基因在棉铃虫幼虫头部和表皮内的表达。【讨论】本研究克隆了棉铃虫HaTO-like基因的全长cDNA序列,分析了该基因的序列特征和表达谱,为进一步阐释该基因的功能奠定理论基础。     

刺五加内生青霉鲨烯合酶基因的克隆与序列分析

【目的】克隆刺五加内生青霉Penicillium minioluteum P116-1a的鲨烯合酶(Squalene synthase,SS)基因。【方法】采用cDNA 5末端快速扩增(Rapid Amplification ofcDNA 5 Ends,5 RACE)技术扩增P.minioluteum P116-1a SS基因的全长cDNA序列和DNA序列;运用生物信息学方法对该基因进行分析,预测其编码蛋白的结构与功能;并通过RT-PCR法和SDS-PAGE法检测SS的表达情况。【结果】P.minioluteum P116-1a的SS基因含有4个外显子和3个内含子,开放阅读框长1 416 bp,编码471个氨基酸,预测蛋白含67.73%的α螺旋,5.31%的延伸链,2.97%的β折叠,23.99%的无规则卷曲,含有鲨烯合酶和八氢番茄红素合成酶的特异性识别区域,定位于内质网膜。与P.marneffei和Talaromyces stipitatus中SS蛋白的氨基酸同源性达90%以上。不同温度下SS的表达情况不同。【结论】首次在刺五加内生青霉P.minioluteum P116-1a中克隆到SS基因,为进一步研究P.minioluteum P116-1a提高刺五加皂苷含量的机制奠定基础。     

意大利蜜蜂amPFK基因的克隆与表达分析

【目的】本研究旨在明确意大利蜜蜂磷酸果糖激酶(amPFK)基因的序列特征及表达模式,为进一步研究amPFK在生殖和发育中的功能奠定理论基础。【方法】采用RT-PCR技术克隆了amPFK基因,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行了分析;通过RT-qPCR检测了amPFK基因在意大利蜜蜂不同品级不同发育时期的表达模式。【结果】克隆获得了意大利蜜蜂amPFK的全长cDNA序列,其中开放阅读框(ORF)2 486 bp,编码757个氨基酸。序列分析表明,amPFK在进化过程中具有较高的保守性,可能存在两个磷酸果糖激酶结构域;amPFK蛋白主要由α-螺旋构成,是一个稳定的亲水性蛋白,具有1个可能的互作蛋白Vha44。表达模式显示,amPFK基因在意大利蜜蜂不同品级、不同发育时期的表达量差异显著(P?0.05);雄蜂、蜂王不同时期amPFK的表达量均呈现出先升高后降低再升高的趋势,羽化成虫后表达量最高;不同品级的幼虫第一日龄amPFK的表达量明显较高,而且羽化成虫后蜂王和雄蜂的表达量明显高于工蜂。【结论】意大利蜜蜂amPFK在蜂王、雄蜂的幼虫初期和成虫期的高表达量可能与其胚后发育初期和生殖发育中细胞增殖的能量代谢有关。     

琥珀蚕丝腺转录因子基因AaSGF-1的克隆、原核表达及组织表达分析

【目的】本研究旨在克隆琥珀蚕Antheraea assama丝腺转录因子基因AaSGF-1,分析其序列特征及表达模式并制备多克隆抗体,为探讨该基因的生理功能奠定基础。【方法】采用RT-PCR和RACE技术从琥珀蚕丝腺中克隆AaSGF-1的cDNA序列,并进行生物信息学分析;利用qPCR检测AaSGF-1在琥珀蚕5龄第4天幼虫不同组织(头、中肠、脂肪体、丝腺、血液、表皮)中的表达模式;构建原核表达质粒载体,在大肠杆菌Escherichia coli BL21中表达AaSGF-1,利用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔子,获得高效的抗体。利用免疫荧光技术检测AaSGF-1在琥珀蚕蚁蚕丝腺和表皮及4龄幼虫丝腺中的表达情况。【结果】克隆了琥珀蚕AaSGF-1的cDNA序列(GenBank登录号： MK889510.1),开放阅读框(ORF)序列长1 050 bp,编码349个氨基酸残基,预测蛋白分子质量为38.8 kD,理论等电点(pI)为8.74。qPCR检测结果显示AaSGF-1在琥珀蚕5龄幼虫丝腺组织尤其是后部丝腺中高量表达,而在其他组织中几乎不表达。免疫荧光结果表明AaSGF-1在蚁蚕及4龄幼虫的丝腺中表达。【结论】本研究原核表达了琥珀蚕AaSGF-1,制备了多克隆抗体,证实了AaSGF-1在琥珀蚕幼虫的丝腺中高表达,为进一步研究该基因在琥珀蚕丝腺发育及丝蛋白合成中的作用奠定了基础。     

小麦条锈菌PsCdc2基因的克隆及在条锈菌侵染小麦后的转录表达分析

【目的】克隆小麦条锈菌细胞分裂基因PsCdc2,分析该基因在条锈菌接种小麦后不同时间点的表达特征。【方法】利用PCR和RT-PCR技术克隆PsCdc2的cDNA序列和基因组序列,采用生物信息学技术预测分析该基因编码蛋白的保守结构域及基本特性,对该蛋白进行系统发育分析,构建进化树;运用实时荧光定量RT-PCR技术,以PsCdc2在夏孢子时期的表达情况为对照,分析该基因在亲和及非亲和互作中不同时间点的表达特征。【结果】PsCdc2基因组序列长2279 bp,由11个外显子和10个内含子构成,开放阅读框为885 bp,编码294个氨基酸,分子量为33.14 kDa,等电点为6.26。编码蛋白含两个保守的激酶特征位点,一个跨膜螺旋区域。PsCdc2基因编码蛋白与小麦秆锈菌、新型隐球菌、玉米瘤黑粉菌等多种真菌的Cdc2高度相似,其中与小麦秆锈菌的Cdc2亲缘关系最近,序列相似性达73.1%。实时荧光定量RT-PCR结果表明,在亲和组合中,该基因在条锈菌接种小麦的前期上调表达,其中接种后12 h时表达量最高,约为夏孢子中表达量的1.62倍,接种后24-268 h,基因表达基本呈下调趋势,其中96 h基因表达量最低,仅为夏孢子时期的0.07倍。在非亲和组合中,该基因表达基本呈下调趋势,在接种后各个时间点的表达量均低于在夏孢子中的表达量,其中接种后12 h时表达量最高,但仅为夏孢子中表达量的0.34倍;接种后96 h表达量最低,为夏孢子中表达量的0.02倍。【结论】PsCdc2可能通过调控条锈菌的细胞周期循环参与了侵染前期初生菌丝生长和吸器母细胞的形成,与条锈菌的致病性相关。本文首次报道了小麦条锈菌的Cdc2基因,为进一步揭示条锈菌细胞周期调控的本质及研究开发靶向Cdc2的新型农药,以及实现对小麦条锈病的新型药剂防治提供了理论基础。     

菊芋Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆与表达分析

根据同源序列设计简并引物,通过RT-PCR及RACE的方法从菊芋中克隆了Na /H 逆向转运蛋白基因。序列分析表明,该基因全长2148 bp,开放读码框为1647 bp,可编码长549个氨基酸的多肽,与其它植物已克隆的Na /H 逆向转运蛋白具有很高的同源性。系统发育分析表明该蛋白(HtNHX1)与液泡型Na /H 逆向转运蛋白的亲缘关系较近,与质膜型Na /H 逆向转运蛋白亲缘关系较远。NaCl胁迫条件下RT-PCR检测结果表明,HtNHX1随NaCl浓度增加和处理时间延长表达持续增强,但到了第3天表达量开始下降。HtNHX1逆向转运蛋白基因的转录调控可能是决定菊芋耐盐能力的一个重要因素。     

Cloning and characterization of a non-TIR-NBS-LRR type disease resistance gene analogue from peach.

Cloning of plant disease resistant genes is greatly helpful for disease resistant breeding in plants and the insight of resistance mechanism. However, there are less relevant researches in peach [prunus persica (L.) Batch]. In this study, four NBS-LRR type resistance gene analogs (RGAs) were cloned from genomic DNA of peach. The PNBS2 fragment was also amplified from peach cDNA and the full-length cDNA of PNBS2 (PRPM1, GenBank accession no. AY599223) has been cloned. Sequence analysis indicated that the cDNA of PRPM1 is 3007 bp in length and that the contained ORF encodes for a polypeptide of 917 amino acids. Compared with known NBS-LRR genes, it presented relatively high amino acid sequence identity. The polypeptide has typical structure of non-TIR-NBS-LRR genes, with NB-ARC, LZ, LRR and transmembrane domains. Southern analysis indicated that the PRPM1 gene might be a single copy in peach genome. Northern blot and RT-PCR analysis showed that the expression of PRPM1 was not induced by salicylic acid (SA) in peach young leaves. The isolation of putative resistance genes from peach provided useful bases for studying the structure and function of peach disease-resistance relating genes and disease resistant genetic breeding in peach.     

一个在肝癌中表达下调的基因syap1的克隆和鉴定

肿瘤细胞区别于正常细胞的最基本特征是细胞生长失控和分化受阻。这种细胞生长失控和分化受阻是由于多种遗传性缺陷积累的结果,这主要表现在两个方面:一是癌基因的激活或过度表达,阻止细胞分化,促进细胞生长;另一方面是肿瘤抑制基因的失活。在肝癌研究中人们发现有多处染色体DNA发生缺失如染色体1p、4q、5q、6q、8p、10p、11p、13q、16q、17p和22q区域,提示这些区域可能存在肿瘤抑制基因。其中13q、17p和8p区域的肿瘤抑制     

马铃薯转化酶抑制子St-inh cDNA克隆及在大肠杆菌中的表达和功能测定

用RT-PCR结合5’RACE方法从马铃薯(Solarium tuberosum L．)栽培种JH块茎中克隆了转化酶抑制子St-inh全长cDNA。序列分析表明,St-inh基因编码区全长663bp,编码221个氨基酸。将含St-inh基因cDNA的DNA片段克隆到pET28a( )上,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功实现了表达。基因表达产物与马铃薯栽培品种(系)E1、JH试管块茎以及番茄果实的转化酶提取物共孵育结果显示,转化酶活性分别下降了34．3％、21％和33．8％,说明St-inh的翻译产物具有转化酶抑制子功能。BLAST基因序列分析表明,St-inh与Kunitz-type C类基因序列同源性达95％以上,T-COFFEE氨基酸序列对比分析显示,该基因编码的蛋白质具有典型的Kunitz-type结构域[L,I,V,M]-X-D-X-[E,D,N,T,Y]-[D,G]-[R,K,H,D,E,N,Q]-X-[L,I,V,M]-X(5)-Y-X-[L,I,V,M],因此,St-inh基因可能为Kunitz-type家族成员。     

青花菜雄性不育相关基因BoDHAR的克隆与表达分析

以一个与甘蓝显性核不育相关的差异表达片段的序列为信息探针,通过在NCBI与TAIR网站数据库中进行同源EST序列搜索,经人工拼接、RT-PCR、PCR克隆与序列分析,获得了青花菜脱氢抗坏血酸还原酶DHARdehydroascorbatereductase基因的cDNA与DNA全长序列,命名为BoDHAR。并利用双链接头介导PCR的染色体步行技术(genomewalking)克隆了其上游644bp的5′端序列。所获的BoDHAR基因全长1486bp,存在两个内含子,DNA编码区序列633bp,编码210个氨基酸;序列分析表明BoDHAR与同源基因AT1G19570.1cDNA序列有82.3%的一致性,推导的氨基酸序列有79.6%的一致性;编码的水溶性蛋白存在多个磷酸化位点;5′端上游区存在明显的转录调控序列。半定量RT-PCR结果表明BoDHAR在可育系花蕾中的表达量明显高于不育系花蕾,在花药中的表达明显高于其它部位。     

百脉根液泡膜H+-PPase基因的cDNA克隆与分析

采用EST电子克隆和RACE技术从豆科模式植物百脉根中克隆到一个液泡膜H -PPase基因的cDNA,命名为LcVP1。该cDNA长为2962bp,含2304bp的完整开放阅读框,编码767个氨基酸,其推测的氨基酸序列与绿豆、拟南芥等I类液泡膜H -PPase的氨基酸序列同源性在80%以上,且有很高的功能区段保守性。该cDNA序列已提交GenBank,登录号为EF440187。半定量RT-PCR表明,LcVP1在根、茎、叶中的表达不同,叶中表达最多,茎中最少。     

Molecular cloning and expression of a second glucuronyltransferase involved in the biosynthesis of the HNK-1 carbohydrate epitope

A cDNA encoding a novel glucuronyltransferase was cloned from a rat brain cDNA library. The cDNA sequence contained an open reading frame encoding 324 amino acids, with type II transmembrane topology. The amino acid sequence revealed 49% homology to rat GlcAT-P, a glucuronyltransferase involved in the biosynthesis of the HNK-1 carbohydrate epitope of glycoproteins, [Terayama et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 6093-6098] and the highest sequence homology was found in the catalytic region. Northern blot analysis indicated that this newly cloned glucuronyltransferase is expressed in the nervous system, consistent with the selective localization of the HNK-1 carbohydrate epitope in the nervous system. Transfection of this cDNA into COS-1 cells induced the expression of the HNK-1 carbohydrate epitope on cell surfaces, and induced the morphological changes in these cells. These results indicated that this newly cloned cDNA is a second glucuronyltransferase involved in the biosynthesis of the HNK-1 carbohydrate epitope.     

大鼠睾丸发育过程中促甲状腺激素释放激素受体mRNA的表达

为研究促甲状腺激素释放激素受体(TRHR)在大鼠睾丸组织中的表达规律和在生殖发育调节中的作用,依据大鼠垂体中的TRH-RcDNA设计引物,采用RT-PCR法从大鼠睾丸组织中获得了TRH-R的cDNA克隆,测序表明其核苷酸序列与大鼠垂体中的TRH-RcDNA序列完全一致.应用非放射性原位杂交(NR-ISH)技术观察TRH-RmRNA在大鼠睾丸中的定位,结果显示杂交信号集中在间质细胞中,生精细胞无杂交信号.利用实时动态定量RT-PCR法观察了TRH-R在不同发育阶段大鼠睾丸中的表达变化,发现在睾丸间质细胞发育的初期阶段(第8天),没有TRH-R的表达,但从第15天起能观察到TRH-R的表达,并且表达量在20天、35天、60天、90天逐渐增加.这些结果表明,大鼠睾丸组织间质细胞能特异性表达TRH-R,并且表达量与发育过程相关.