苏云金芽胞杆菌G03 spoIVF操纵子敲除对芽胞和晶体形成的影响

spoIVF是一个普遍存在于芽胞杆菌中的操纵子。在枯草芽胞杆菌中,它编码的两个蛋白是芽胞形成所必需的。采用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌G03菌株中的spoIVF操纵子,构建了spoIVF缺失株G03(spoIVF-)。研究表明:该突变株丧失了形成芽胞和晶体的能力。lacZ基因与cry1Aa基因的启动子融合表达分析发现:突变株中的cry1Aa基因的活性严重降低。利用载体pSTK携带spoIVF操纵子在突变株中的表达,使突变株部分恢复了产胞和形成杀虫晶体蛋白的能力。这说明spoIVF操纵子是所必需的,同时该操纵子还影响σ^E因子控制的cry1Aa基因表达。     

苏云金芽胞杆菌Sigma54和CcpA共同调控的基因鉴定

【目的】通过综合分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)HD73菌株Sigma54缺失突变体的转录组数据和蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)ATCC 14579菌株CcpA缺失突变体的转录组数据,并进行启动子与CcpA蛋白的体外结合验证,明确Bt HD73菌株中Sigma54和CcpA共同调控的基因,丰富了对微生物的代谢调控网络的认识。【方法】以转录组测序结果为基础,通过基因同源性的比对在Bt HD73菌株中寻找受Sigma54和CcpA共同调控的基因,在这些基因中找到具有cre序列的启动子,通过凝胶阻滞验证这些启动子与CcpA蛋白的结合。【结果】Bt HD73菌株中有31个基因受Sigma54和CcpA共同调控,其中14个基因的启动子序列包含cre序列,这些启动子都可以与CcpA蛋白发生体外结合。【结论】Bt HD73菌株中有14个基因直接受CcpA的调控,同时其转录受Sigma54的控制。     

苏云金芽胞杆菌Sigma K在大肠杆菌中的表达与纯化

【目的】在大肠杆菌中表达纯化苏云金芽胞杆菌HD73的转录调控因子Sigma K(σK)。【方法】PCR扩增出苏云金芽胞杆菌HD73中sig K基因的ORF(Open reading frame)装载到带有His标签的表达载体p ET21b上,转入到表达菌株BL21(DE3)中获得重组菌株BL21(p ETsig K),通过SDS-PAGE、镍柱亲和纯化、阴离子交换纯化和凝胶迁移实验(EMSA)等方法对Sigma K蛋白进行提取、纯化和生物活性分析。【结果】正确表达出大小约为27 k D的His-Sigma K蛋白,并获得了纯化的蛋白。EMSA结果表明纯化的His-Sigma K蛋白可以与受其控制的cry1Ac基因启动子结合。【结论】表达和纯化了His-Sigma K蛋白,His-Sigma K具有与受其控制的启动子结合的功能。     

苏云金芽胞杆菌rocE基因的转录调控

【目的】rocE基因编码精氨酸降解途径中的精氨酸通透酶,通过分析苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt) rocE基因的转录活性,明确rocE基因的转录调控机制。【方法】通过RT-PCR确定rocE基因所在基因簇的转录单元;β-半乳糖苷酶活性测定分析rocE基因启动子(ProcE)的转录活性;采用同源重组技术敲除BtHD73菌株的rocE基因;通过融合His标签的方法在大肠杆菌中表达纯化RocR蛋白的HTH结构域;通过凝胶阻滞实验明确RocR与rocE基因启动子的结合作用。【结果】在M9培养基中,精氨酸可诱导ProcE的转录活性;在SSM培养基和精氨酸诱导培养基中,与出发菌株HD73相比,ProcE在sigL (编码Sigma54因子)突变体和rocR突变体中的转录活性显著下降。RocR-HTH蛋白与ProcE有结合作用。rocE基因的缺失对菌体生长和Cry1Ac蛋白产量无显著影响。rocE缺失突变体的芽胞形成率为65.5%,HD73出发菌株为85.7%,显著性分析结果表明差异显著(P0.05)。【结论】rocE基因的转录活性受Sigma54的控制,并受RocR正调控。rocE基因的缺失影响菌株的芽胞形成率。     

苏云金芽胞杆菌G03 spoIVF操纵子敲除对芽胞和晶体形成的影响

spoIVF是一个普遍存在于芽胞杆菌中的操纵子。在枯草芽胞杆菌中,它编码的两个蛋白是芽胞形成所必需的。采用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌G03菌株中的spoIVF操纵子,构建了spoIVF缺失株G03(spoIVF-)。研究表明:该突变株丧失了形成芽胞和晶体的能力。lacZ基因与cry1Aa基因的启动子融合表达分析发现:突变株中的cry1Aa基因的活性严重降低。利用载体pSTK携带spoIVF操纵子在突变株中的表达,使突变株部分恢复了产胞和形成杀虫晶体蛋白的能力。这说明spoIVF操纵子是所必需的,同时该操纵子还影响σE因子控制的cry1Aa基因表达。     

双组份系统YvcPQ抑制苏云金芽胞杆菌的芽胞形成

【目的】探究双组份系统YvcPQ影响芽胞形成的机制。【方法】利用β-半乳糖苷酶活性实验验证YvcP对芽胞形成抑制因子KapD的调控作用;通过无痕基因敲除并分别比较突变株与出发菌株的芽胞产率,研究YvcPQ及KapD对芽胞形成的影响;应用细菌单杂交实验、EMSA实验和实时荧光定量PCR技术探究转录调控因子AbrB对yvcPQ操纵子的转录调节。【结果】YvcP可以正调控kapD的表达,从而抑制芽胞形成;yvcPQ不能受YvcP的自调控,而是受AbrB转录激活。【结论】调控因子AbrB能够通过正调控yvcPQ操纵子的转录来提高细胞内YvcP的含量,进而增强YvcP对芽胞形成抑制因子编码基因kapD的表达,最终抑制芽胞的形成。     

转化crylC基因对苏云金芽胞杆菌杀虫活性的影响

将含基因crylC的质粒 ,通过电脉冲法转入含基因CrylC的质粒 ,通过电脉冲法转入含基因CrylAb、CrylAc和cry2的对小菜蛾具有高毒力的苏云金芽胞杆菌野生菌株YBT-803-1中 ,得到转化子BMBY-003。PCR和SDS PAGE分析显示 ,CrylC可在其中正常复制、表达 ,但使受体菌部分内源质粒发生丢失。生物测定结果表明 ,转化子BMBY-003既对甜菜夜蛾有毒力 ,LC₅₀ 值     

苏云金芽胞杆菌杀线虫伴胞晶体蛋白基因cry6Aa的克隆与表达

通过对晶体蛋白N-末端氨基酸测序,设计简并探针,从对根结线虫高毒力苏云金芽胞杆菌YBT-1518菌株中克隆到1个含有杀线虫晶体蛋白基因的片段。序列测定表明该序列含有两个ORF(orf1和orf2),其中orf1与基因cry6Aa1同源性为98%,已在GenBank上登录(Acc.NO.AF499736),并被命名为cry6Aa2。将克隆的该片段克隆到穿梭载体pHT304上,并转化苏云金芽胞杆菌无晶体突变株BMB171,重组菌株可形成米粒状伴胞晶体。生物测定表明,表达的毒素蛋白对北方根结线虫的LC₅₀为9.47μg/mL,毒力与出发菌株(10.74μg/mL)相当。     

利用ERIC-PCR对苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌进行鉴定的研究

为了探索ERIC-PCR技术在苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的鉴定及分型中的应用价值,本研究采用PCR方法初步检测苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的组成,并对苏云金芽胞杆菌和蜡状芽胞杆菌的总DNA进行ERIC-PCR扩增,分析ERIC-PCR指纹图谱的特点并采用NTSYS2.10软件对其进行聚类。结果显示,各菌株的ERIC指纹图谱表现出不同程度的多态性,但图谱与菌株所含cry基因的类型存在一定的相关性。聚类分析结果显示,含有相同或相近cry基因类型的Bt菌株在进化树上趋向聚为一类,而不含cry基因的蜡状芽胞杆菌趋向于与不含cry基因的Bt菌株聚为一类或单独聚类。若在多种模式菌株的参考下,该方法可用于苏云金芽胞杆菌的初步鉴定和分型。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类

１９８９年Ｈｏｆｔｅ和Ｗｈｉｔｅｌｅｙ根据氨基到序列的同源性和杀虫谱双重标准将苏云金芽胸杆菌杀虫晶体蛋白基因划分为５类１４亚类。根据双重标准出现的问题和冲突,给分类带来了困扰,为此１９９５年,只根据氨基酸序列的同源性进行分类。现已将基因分为２１群,４４亚群,６４类,１１６个亚类。本文介绍了纳入新系统的条件、分类原则、命名方法、定名步骤和分类中值得注意的问题。     

苏云金杆菌Bt4.0718不同时期比较转录组揭示芽胞和杀虫伴胞晶体形成机制

【目的】苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)在形成芽胞的过程中产生大量杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs),是目前应用最广泛、最安全的微生物杀虫剂的主要菌株资源。本研究旨在比较Bt 3个重要时期的转录组,进一步探究芽胞和杀虫伴胞晶体的形成机制,为高效工程菌的构建奠定理论基础。【方法】选取高毒力Bt4.0718菌株营养生长中期(T1-10h)、芽胞形成前期(T2-20 h)、芽胞形成后期(T3-32 h)进行比较转录组分析,对代表性差异基因进行实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)验证、特定功能基因的敲除和表型分析验证。【结果】差异表达基因数量分别为2 147个(T2/T1)、1 861个(T3/T1)、1 708个(T3/T2)。T1时期,培养基中营养相对丰富,主要为芽胞和杀虫伴胞晶体形成做准备。芽胞形成重要调控基因kinA/D、spo0A/F、sigE高水平转录对菌体的生长发育具有重要作用,Cry1Ac、碳源、能源贮藏物聚...     

The occurrence of disporousBacillus thuringiensis cells

Ultrathin sections of sporulatingBacillus thuringiensis were examined in a transmission electron microscope. Less than 1% of the about 2,000 approximately sagittal sections of the bacterial cells examined contained two endospores per cell. This finding clarifies the majority of textbook and research reports (which tend to be ambiguous), contradicts several of the most recent textbook reports, and confirms three unillustrated textbook reports, in relation to the occurrence of disporous bacilli. Electron microscopic evidence of the observation is presented, apparently for the first time.     

Influence of pH Control Agents on Entomotoxicity Potency of Bacillus thuringiensis using Different Raw Materials

Summary In this investigation, ammonium hydroxide and acetic acid were used as pH control agents during Bacillus thuringiensis (Bt) fermentation in a pilot scale fermentor (150-l) employing two secondary wastewater sludges from two different wastewater treatment plants (CUQS and JQS) and semi-synthetic soybean meal medium as raw materials. Regardless of the cultivation medium, a substantial increase in total cell count, spore count, protease activity and entomotoxicity was achieved when the pH of the culture was controlled using NH₄OH/CH₃COOH. At harvest, total cell count increased by almost 17%, 33% and 25%; protease activity was enhanced by 12%, 33% and 53% and maximal spore count augmented by almost 28%, 48% and 33% in CUQS, JQS and soybean medium, respectively. Entomotoxicity potency was improved by 22%, 21% and 14% in CUQS, JQS and soybean medium, respectively compared to results obtained with NaOH/H₂SO₄ as pH control agents. A higher entomotoxicity was also observed using sludge compared to the soybean medium. This improvement of the Bt process performance was a consequence of the addition of rapidly utilizable carbon and nitrogen source through pH control, which stimulated endotoxin production in the crystal and enhanced sporulation.     

苏云金芽胞杆菌抗癌晶体蛋白的研究进展

抗癌晶体蛋白(parasporins,PS)是由没有杀虫活性的苏云金芽胞杆菌产生的一种晶体蛋白,在经过蛋白酶酶解后产生的活性多肽对来自人类不同组织的癌细胞具有特异性细胞毒性,而对正常细胞具有较低毒性或不具有毒性,是一种具有很大潜力的微生物抗癌蛋白。就最近几年苏云金芽胞杆菌中已发现的抗癌晶体蛋白的种类、结构特征、细胞活性谱和杀虫机制进行简要概述。     

苏云金芽胞杆菌等离子复合体诱变提高抗鳞翅目害虫的杀虫毒力

[目的]苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)D18对鳞翅目、鞘翅目等农业害虫具有杀虫毒力,本研究拟通过复合诱变育种,筛选出杀虫毒力更高的突变菌.[方法]经四轮室温常压等离子体(ARTP)诱变和一轮ARTP-NTG复合诱变后,镜检形态观察与生物毒力测定筛选高毒力菌株,SDS-PAGE检测C...     

C端结构域截短提高苏云金芽孢杆菌来源几丁质酶的活力

[目的]尝试利用蛋白质结构域工程的手段优化苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis BMB 171)来源的几丁质酶BtChiA的酶活力,并对水解胶体几丁质的产物进行定性和定量分析.[方法]根据BtChiA的序列分析其结构域的组成,构建BtChiA及部分结构域缺失的突变体蛋白在大肠杆菌中的表达菌株并进...     

Response of the Carrot Weevil,Listronotus oregonensis(Coleoptera: Curculionidae), to Strains ofBacillus thuringiensis

Mortality and frass production bioassays were used to investigate the toxicity of seven strains ofBacillus thuringiensisagainst the adult carrot weevil,Listronotus oregonensis(Le Conte). A semi-artificial diet of carrot foliage with 4% agar was selected to maximize feeding by the insects.Bacillus thuringiensissubsp.tenebrionis(Krieg, Huger, Langenbruch, and Schnetter) (BTT) and two unidentifiedB. thuringiensisstrains, A30 and A429, gave the lowest LC₅₀values. The frass bioassay supported the conclusions of the mortality assay. Mortality of adults continued after their removal from the insecticidal medium, with the highest mortality being caused by strains A429 and BTT. Survivors from the frass bioassay, initially exposed to strains A30, A429, and BTT, did not resume normal levels of feeding after their removal from the insecticidal medium.