中间锦鸡儿CiNAC038启动子的克隆及对激素响应分析

NAC转录因子家族是植物中特有的、家族数目较多的一类转录因子家族,对植物生长发育起重要作用。了解CiNAC038的表达调控分子机制,为中间锦鸡儿CiNAC038功能研究奠定基础。以中间锦鸡儿为植物材料,通过染色体步移法克隆启动子序列,并对启动子序列上的响应元件进行分析。构建GUS表达载体,并转化拟南芥,对拟南芥的组织特异性进行表达分析,用ABA诱导转基因植株,研究ABA与CiNAC038的关系。结果显示,克隆了1 800 bp的CiNAC038启动子序列,该启动子包含多种顺式元件。成功构建植物表达载体ProCiNAC038∶GUS,通过浸花法转化至野生型拟南芥。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗根部染色较深,胚轴无染色;成熟期转基因拟南芥的叶脉、果荚两端、花瓣、花药等组织染色较深,茎无染色。CiNAC038启动子驱动的GUS报告基因主要在植物叶片、根和花的组织器官表达。进一步ABA诱导表达分析发现,GUS染色随着浓度增加颜色越浅。CiNAC038启动子是ABA抑制型启动子。     

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶基因启动子逆境诱导表达特性研究

为研究6-磷酸山梨醇脱氢酶(sorbitol-6-phosphate dehydrogenase,S6PDH)基因启动子(S6PDHp)的逆境诱导表达特性,利用Gateway技术构建了S6PDH基因启动子区5'端系列缺失体与GUS基因的融合表达载体,并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对转基因拟南芥进行低温和外源ABA处理,通过GUS蛋白活性变化分析S6PDHp的逆境诱导表达特性。研究结果发现,通过Gateway技术构建了4个S6PDHp 5'端系列缺失体与β-葡萄糖苷酸酶(GUS)基因的融合表达载体(pGWB433-S6PDHp1、pGWB433-S6PDHp2、pGWB433-S6PDHp3和p GWB433-S6PDHp4)并获得了相应的转基因拟南芥。对转基因植株进行低温处理后发现,p GWB433-S6PDHp3转基因植株中的GUS活性增幅最大,达到显著水平,而其他转基因植株中的GUS活性基本保持不变。外源ABA处理后发现,除p GWB433-S6PDHp4外,其余启动子缺失体转基因拟南芥中GUS活性显著升高。以上结果表明,低温和外源ABA能够诱导S6PDHp的表达,但不同的缺失体响应程度不同,意味着在S6PDHp序列(-2 396bp至-236bp)中可能存在着响应逆境胁迫的正负调控顺式作用元件。     

玉米脱氧麦根酸分泌通道蛋白基因YS3启动子的克隆与启动活性分析

缺铁是世界范围内农业生产面临的严重问题,玉米通过分泌脱氧麦根酸(2’-deoxymugineic acid, DMA)吸收利用土壤中的难溶性铁。为探明玉米DMA分泌通道蛋白基因YS3的表达和调控机制,本文通过克隆获得长为2813 bp的YS3基因启动子,该序列含有大量TATA-box、CAAT-box等启动子基本元件,以及光响应、激素调控等多个顺式调控元件;构建YS3启动子驱动GUS基因的植物表达重组载体pCAMBIA-YS3GUS,利用农杆菌介导转化拟南芥,获得pYS3::GUS转基因植株,对转基因植株进行GUS组织化学染色,并通过石蜡切片技术对转基因植株进行组织观察,分析pYS3::GUS转基因植株中YS3基因启动子的活性。结果表明,YS3启动子主要驱动GUS基因在拟南芥根部表达,且主要集中在根部表皮细胞,机械损伤可激发YS3启动子活性,驱动GUS基因在损伤临近部位表达。本研究对于理解玉米DMA分泌的分子调控机理方法od3 gmaigensuan有重要意义。     

百子莲脱水素基因ApY2SK2逆境应答模式及启动子调控功能研究

在百子莲胚性细胞中筛选到对超低温保存复合逆境具有积极响应的保护类蛋白脱水素(ApY_2SK_2),为探明ApY_2SK_2基因在复合逆境中的应答模式,该研究采用染色体步移技术克隆并分析了ApY_2SK_2编码基因上游1 200 bp的启动子序列。结果表明:(1)序列分析显示,该启动子含有多个与逆境和激素诱导相关的顺式调控元件;实时荧光定量PCR结果表明,ApY_2SK_2基因的表达具有组织特异性,在百子莲的叶和果中表达量较高,且在多种胁迫处理与ABA激素诱导下,其表达量显著升高。(2)成功构建了5个ApY_2SK_2启动子不同缺失片段驱动GUS基因的融合表达载体,经农杆菌转化、抗性筛选和PCR检测鉴定,获得T_3代纯和转基因拟南芥株系。(3) GUS组织化学染色结果显示,GUS基因在拟南芥幼苗全株、成年苗的叶、花和成熟果实中表达活性较强,但在未成熟果实中无明显表达;烟草瞬时表达结果显示,与对照组相比,在脱水胁迫和ABA处理下的ApY_2SK_2启动子不同缺失片段驱动GUS基因表达具有显著差异。(4)转基因拟南芥GUS活性测定结果显示,ApY_2SK_2启动子MBS元件和ABRE元件可响应干旱与渗透胁迫信号;ApY_2SK_2启动子LTR元件参与低温响应;ApY_2SK_2启动子-1 199～-262 bp区域包含多个串联的ABRE顺式调控元件(-373～-211 bp)对响应ABA信号具有主要调控作用。该研究结果揭示了ApY_2SK_2启动子的组织特异性,且启动子上的关键顺式调控元件对不同的胁迫和激素信号响应具有决定性调控作用。     

ocs/mas|一个受损伤和植物激素诱导的嵌合启动子的构建与功能分析

选择适宜的转录调控序列以提高启动子的转录效率,增强外源基因在转基因植株中的表达,对改良作物的抗病虫性具有重要意义。将甘露碱合成酶基因(mas)启动子和章鱼碱合成酶基因(ocs)增强子杂合而成的嵌合启动子ocs/mas与GUS报告基因连接,构建了植物表达载体pOMS-GUS。对照载体pMAS-GUS仅携带mas启动子驱动的GUS基因。利用根癌农杆菌介导法,将以上植物表达载体分别转化烟草。应用半定量RT-PCR和GUS荧光定量分析法分别检测不同胁迫条件下启动子驱动的GUS基因表达量的变化。结果显示,未诱导处理的转基因植株GUS基因仅有微弱表达。伤害处理1h后,mas启动子驱动的GUS活性是未诱导处理的1.8倍,而嵌合启动子ocs/mas的诱导表达活性是未处理的5.7倍。植物激素水杨酸(SA)和茉莉酸甲酯(MJ)处理也诱导了较高水平的ocs/mas嵌合启动子活性;而且SA和MJ联合作用时呈现叠加效应,转基因烟草的GUS活性明显高于伤害处理后的GUS表达水平。以上结果表明,ocs/mas嵌合启动子是一种强诱导型启动子,可以接受多种刺激因子的诱导,从而为更有效地改良作物抗病虫的能力提供新的候选高效启动子元件。     

拟南芥非特异性磷脂酶C4基因表达模式的研究

拟南芥非特异性磷脂酶C4（AtNPC4）具有降解磷脂酰胆碱（PC）,产生二酰甘油（DAG）和磷酸胆碱的活性。本研究从拟南芥基因组中分离了NPC4基因起始密码子上游1 379bp的启动子序列,与GUS报告基因融合后转化拟南芥,获得转基因植株。GUS组织化学染色表明,AtNPC4基因主要在处于衰老过程中的叶片中高水平表达,在根、茎、种荚和花中也有一定程度的表达,这种表达模式与RT-PCR结果相一致。另外,通过RT-PCR发现,AtNPC4基因在转录水平上受脱落酸的诱导,但不受水杨酸和茉莉素诱导。     

拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列克隆及其活性分析

目的:克隆拟南芥AtNCED2基因启动子区域序列,并分析其组织器官特异性及对外界刺激的响应.方法:通过PCR从拟南芥基因组中克隆AtNCED2基因5'侧翼2295bp启动子区域序列(AtNCED2p),并进行生物信息学分析.构建AtNCED2p驱动GUS的植物双元表达载体pAtNCED2p::GUS,通过根癌农杆菌介导法将其转化野生型拟南芥,检测转基因植侏中GUS表达的组织器官特异性.结果:该启动子序列中存在TATA-box、CAAT-box、根器官特异性元件、ABA响应元件、低温响应元件、昼夜节律响应元件等顺式作用元件.GUS活性主要集中在转基因拟南芥根尖及侧根发生部位.外源ABA处理的转基因植株根中GUS活性为174.8nmol 4-MU min-1 mg-1蛋白,明显高于对照值91.7nmol 4-MU min-1mg-1蛋白.结论:AtNCED2基因可能在根的生长和发育中起作用,且外源ABA处理增强其在根中的表达.     

盐穗木盐相关转录因子HcSCL13基因启动子的克隆及活性初步分析

为探明盐穗木盐相关转录因子基因Hc SCL13的表达调控规律,利用基因组步移法成功克隆获得该基因2 200 bp的启动子序列。Plant CARE数据库分析结果表明,该启动子不仅含有启动子区的核心元件CAAT-box和TATA-box,还包含多个与逆境应答有关的顺式调控元件。将克隆获得的Hc SCL13转录因子基因启动子序列定向替换p BI121载体上的35S启动子,构建融合表达载体并转染模式植物拟南芥,对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色。结果显示转基因拟南芥整株被染色,提示该启动子具有表达活性且可能为组成型启动子。     

拟南芥中人工启动子GWSF转录特性及乙烯诱导活性分析

理想的病原诱导型启动子可用来精确调控抗病基因的时空表达,消除转基因中的副作用。选用Gst1-box、W-box、S-box、F-box元件和CaMV minimal 35S启动子设计长度为374 bp的人工启动子GWSF。用GWSF替代p BI121中调控gus基因的CaMV 35S启动子后,将重组质粒导入农杆菌GV3101,并通过花序浸泡法得到转GWSF:gus拟南芥。以T_4代植株为材料,GUS染色发现GWSF本底表达低,受疫霉菌、青枯菌及抗病信号分子水杨酸的诱导,但不受非致病菌大肠杆菌和逆境激素脱落酸(ABA)的诱导。序列分析发现,GWSF含有乙烯应答元件(ERE)。用乙烯处理T_4代转基因植株,通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测GWSF的乙烯诱导活性。当乙烯浓度为0.2 mmol·L~(-1)时,GWSF转录活性最高,达到CaMV 35S的11.33倍。结果表明,GWSF是较为理想的植物病原和乙烯诱导型启动子,具有本底表达低、诱导因子广、启动表达快、诱导效率高等优点,可用于植物转基因抗病育种。     

獐茅HAK基因表达调控区的分离及其在水稻中的功能分析

獐茅高亲和性K+转运蛋白基因(AlHAK1)是从单子叶禾本科盐生植物獐茅(Aeluropus littoralis(Gouan)Parl)中克隆,对于细胞营养和离子渗透调节起关键作用。为了进一步了解AlHAK1基因的表达调控机制,文章采用基因组步移法分离了AlHAK1基因转录起始位点上游长度约1.3 kb的启动子区域。启动子顺式元件分析显示该序列具有典型的TATA和CAAT盒,以及一些与植物生长发育和环境响应相关的顺式元件。为了明确AlHAK1启动子的功能,将其与GUS基因融合构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,通过农杆菌介导转化法导入水稻中。对转基因植株进行GUS组织化学染色,结果显示在转化AlHAK1启动子水稻的根、茎、叶、花药和内外稃部位均检测到GUS活性。GUS荧光定量分析显示AlHAK1启动子调节GUS表达活性低于组成型启动子CaMV35S和Ubiquitin,但其根部和茎部的GUS活性相对较高。对转化植株进行不同胁迫处理后检测GUS活性,结果表明受到ABA、干旱、高温的诱导后其茎部和根部GUS活性有所提高,推测位于该启动子-682 bp的HSE元件和-1 268 bp的MybBS元件可能在高温、ABA和干旱诱导的表达调控中起作用。     

水稻胁迫相关基因OsPM1启动子的克隆与分析

依据NCBI数据库OsPM1的序列信息,采用PCR技术扩增获取OsPM1的2 100bp的启动子序列。利用PLACE预测启动子的顺式作用元件分析表明,启动子内含有大量与胁迫相关的顺式作用元件,主要有ABA响应相关元件、脱水响应元件、低温响应元件、热激响应元件和转录因子结合元件。构建OsPM1的启动子和GUS基因融合表达载体,转入拟南芥。组织化学染色分析结果显示,非生物胁迫处理前,幼苗中GUS基因表达水平很低;干旱、低温、高盐等胁迫处理后,GUS基因表达量显著升高。研究表明,OsPM1的启动子能够显著提高在干旱、高盐和低温处理后下游基因的表达水平。     

siRNA介导的ERA1表达下调对拟南芥抗旱性的影响

ERA1是控制植物气孔开闭的一个重要基因,根据其保守域构建RNA干扰(RNAi)载体并转化拟南芥,考察转基因植株的生长、气孔导度、离体叶片失水率以及ERA1和相关基因表达,探讨siRNA介导的ERA1表达下调对拟南芥抗旱性的影响。结果表明:转基因拟南芥株系中ERA1的表达受到明显抑制,其离体叶片失水率低于野生型,但并未出现ERA1缺失突变体的负面生长表型;转基因株系对ABA处理比野生型更敏感,其ABA处理株的根长显著变短,气孔孔径更小;转基因株ABI1、ABI2、ATHB6的表达量降低,而RAB18、RD29B、ADH1的表达量升高,siRNA介导的ERA1表达下调可能会激活RAB18、RD29B等逆境响应元件。研究发现,采用RNAi技术可以有效下调ERA1表达,在没有过多负面生长表型的前提下提高拟南芥的抗旱性,且ERA1表达下调可能通过ABA途径正面影响拟南芥的抗旱性。     

大麦与油菜种皮特异启动子表达模式的比较

启动子位于转录起始位点上游并能特异性地结合RNA聚合酶,其作为调控序列驱动外源基因在异源植物中表达,从而实现转基因的高效性,具有时空表达特异性的启动子对获得有效转基因植物及产物具有重要意义。为了解种皮特异启动子的表达模式,该研究基于前期报道的序列,通过同源克隆的方法分别从大麦和油菜中克隆获得Gerb和Bntt两个种皮特异性启动子,并对其进行生物信息学分析,构建了Gerb::GUS和Bntt::GUS植物表达载体并转化拟南芥,通过组织化学染色观察了GUS的表达情况。结果表明:两种启动子序列中都含有多拷贝种皮特异表达启动子元件以及多种胁迫诱导响应元件;转基因拟南芥幼苗期,大麦Gerb种皮特异启动子驱动GUS全株表达且子叶和下胚轴较真叶和根中表达量高;油菜Bntt种皮特异启动子表达较弱;成株期,Gerb在不同组织(叶片、茎、花序和角果)中均有表达,未显示组织特异性;Bntt仅在叶片及角果维管束中有微弱表达。在各种非生物胁迫下,Gerb表达模式未发生显著变化,而Bntt仅在盐胁迫下显示很强的角果和种子特异性表达,其他胁迫未见明显表达。以上结果显示,大麦种皮特异性启动子Gerb和油菜种皮特异性启动子Bntt在时间和空间表达模式上存在差异,这对今后选择种皮特异启动子具有参考作用,但其具体机制仍需进一步研究验证。     

小立碗藓PpAGO7基因启动子分离及其启动活性分析

AGO7蛋白在多种植物中被发现并预测在叶片生长发育过程中起作用,但是在高等植物中最古老且唯一没有维管束的苔藓植物中却未有报道。该文通过BLAST比对水稻OsAGO7基因编码的氨基酸序列得到小立碗藓AGO7蛋白编码基因PpAGO7,扩增PpAGO7基因起始密码子上游的启动子序列,利用在线软件PlantCARE和PLACE分析该启动子的结构特征;并构建启动子分析载体pPpAGO7-GUS,转化拟南芥,通过转基因拟南芥GUS染色结果分析推测PpAGO7启动子的启动特性。结果显示:(1)PpAGO7基因启动子序列中含有大量的光反应有关的顺式作用元件以及数个分生组织相关和防御与胁迫相关作用元件。(2)T2代转基因拟南芥的GUS染色结果表明,PpAGO7基因启动子会启动GUS在拟南芥的不同部位和不同生长时期表达,而且在根尖、叶片顶端、雄蕊的花药、雌蕊的柱头和种子等部位的染色较其他部位更深。(3)生长在光照强度1 000lx和4 000lx下转基因拟南芥的GUS酶活性比光照强度7 000lx和10 000lx下的低。研究表明所克隆的PpAGO7基因启动子具有组成性启动活性,且在生长旺盛的部位启动活性较强,此外其启动活性还受到光照因素的影响,为进一步研究小立碗藓的PpAGO7基因功能提供了重要依据。     

拟南芥AtNHX6基因启动子的克隆及表达分析

为了探明拟南芥内膜反向转运体AtNHX6基因的组织表达模式,从基因组中克隆了AtNHX6基因开放阅读框(ORF)上游侧翼调控区1 922bp序列,并成功构建AtNHX6基因启动子与GUS融合表达载体pCAM-BIA1381-proNHX6-GUS,通过农杆菌花序浸染法转化野生型拟南芥获得T3代纯合转基因拟南芥株系,经PCR检测扩增得到2 187bp目的条带。利用组织染色法鉴定转基因拟南芥的GUS表达模式发现,在子叶、下胚轴和花中GUS活性显著。在这些广泛表达的部位中,微管系统中的表达最为显著,真叶中只有局部检测到GUS表达;在根中GUS在根毛和侧根生长部位表达;在未成熟果荚中只有在果荚顶端和基部存在GUS活性,成熟果荚中只在果柄检测到GUS表达;在花中,雄蕊的花丝和花粉粒及雌蕊的柱头中检测到GUS表达。GUS染色分析结果表明,AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达,且AtNHX6基因主要在拟南芥的子叶、下胚轴、根、花、果荚中的微管系统、根毛和侧根生长部位以及花丝、花粉、柱头中表达。     

Isolation of a maize beta-glucosidase gene promoter and characterization of its activity in transgenic tobacco

The β-glucosidase gene of maize (ZmGLU1) was suggested to hydrolyze cytokinin-conjugate and release free cytokinin during plant growth and development. A clone containing the upstream region of ZmGLU1 was isolated and sequenced from a maize genomic library. The full-length ZmGLU1 promoter and a series of its 5′ deletions were fused to the beta-glucuronidase (GUS) reporter gene and transferred into tobacco. The GUS activity of transgenic plants was assayed at various developmental stages. The results showed that ZmGLU1 promoter-driven GUS gene had the highest expression level in the roots and that the expression of GUS gene declined during seed maturation and down to the lowest level in mature seeds. The ZmGLU1 promoter-driven GUS expression increased during seed germination, reaching a peak on day 11. The results also showed that this promoter could be inhibited by 6-BA, trans-zeatin, and NAA, but was not affected by GA₃, ABA, SA, cold, salt, drought, and submergence treatments. The histochemical staining revealed that GUS activity was located in vigorous cell division zones with dominant staining associated with vascular tissues. Deletion analysis showed that the promoter contained a putative leaf-specific and stem-specific negative regulative element and two putative enhancers.     

Characterization of the expression of a desiccation-responsive rd29 gene of Arabidopsis thaliana and analysis of its promoter in transgenic plants

Summary We characterized the expression of genes that correspond to a cDNA clone, RD29, which is induced by desiccation, cold and high-salt conditions in Arabidopsis thaliana. Northern analysis of desiccation-induced expression revealed a two-step induction process. Early induction occurs within 20 min and secondary induction occurs 3 h after the start of desiccation. Exogenous abscisic acid (ABA) induces RD29 mRNA within 3 h. Two genes corresponding to RD29, rd29A and rd29B, are located in tandem in an 8 kb region of the Arabidopsis genome and encode hydrophilic proteins. Desiccation induces rd29A mRNA with two-step kinetics, while rd29B is induced only 3 h after the start of desiccation. The expression of both genes is stimulated about 3 h after application of ABA. It appears that rd29A has at least two cis-acting elements, one involved in the ABA-associated response to desiccation and the other induced by changes in osmotic potential. The -glucuronidase (GUS) reporter gene driven by the rd29A promoter was induced at significant levels by desiccation, cold, high-salt conditions and ABA in both transgenic Arabidopsis and tobacco. Histochemical analysis of GUS activity revealed that the rd29A promoter functions in almost all the organs and tissues of vegetative plants during water deficiency.     

Constitutive expression of a meiotic recombination protein gene homolog, OsTOP6A1, from rice confers abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants

Plant productivity is greatly influenced by various environmental stresses, such as high salinity and drought. Earlier, we reported the isolation of topoisomerase 6 homologs from rice and showed that over expression of OsTOP6A3 and OsTOP6B confers abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants. In this study, we have assessed the function of nuclear-localized topoisomerase 6 subunit A homolog, OsTOP6A1, in transgenic Arabidopsis plants. The over expression of OsTOP6A1 in transgenic Arabidopsis plants driven by cauliflower mosaic virus-35S promoter resulted in pleiotropic effects on plant growth and development. The transgenic Arabidopsis plants showed reduced sensitivity to stress hormone, abscisic acid (ABA), and tolerance to high salinity and dehydration at the seed germination; seedling and adult stages as reflected by the percentage of germination, fresh weight of seedlings and leaf senescence assay, respectively. Concomitantly, the expression of many stress-responsive genes was enhanced under various stress conditions in transgenic Arabidopsis plants. Moreover, microarray analysis revealed that the expression of a large number of genes involved in various processes of plant growth and development and stress responses was altered in transgenic plants. Although AtSPO11-1, the homolog of OsTOP6A1 in Arabidopsis, has been implicated in meiotic recombination; the present study demonstrates possible additional role of OsTOP6A1 and provides an effective tool for engineering crop plants for tolerance to different environmental stresses. Electronic supplementary material The online version of this article (doi:) contains supplementary material, which is available to authorized users.