用原位分子杂交技术定位牛生长激素基因于5号染色体

本工作利用放射性标记的ｂＧＨ基因（３．０ｋｂ）为探针,通过原位杂交定位牛生长激素基因于染色体５ｑ２２－２６内。该结果与以前的ｂＧＨ基因定位的结果不同,讨论了基因探针、基因定位方法等方面与定位准确性的关系。     

牛生长激素基因的人工合成,重组克隆及高效表达

本文通过设计选择大肠杆菌高频利用密码子代替天然密码子,人工全合成３２个寡聚核苷酸片段;连接并克隆获得Ａ（２７８ｂｐ）、Ｂ（８８ｂｐ）、Ｃ（２２４ｂｐ）３个较大ＤＮＡ片段;经重组克隆、定位突变等获得阳性克隆;双向ＤＮＡ序列测定分析表明获得了两种人工全合成牛生长激素（ｂＧＨ）编码基因,即编码Ｎ－Ｍｅｔ－Ａｌａ－ｂＧＨ和Ｎ－Ｍｅｔ－Ｐｈｅ－ｂＧＨ的两个基因,而至今尚未见有人工全合成ｂＧＨ基因的报道。构建了在ＰＬｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下含上述合成基因的表达质位ｐＢＬｂＧＨＥ７Ａ１和ｐＢＬｂＧＨＥ８,并在大肠杆菌中进行了温敏诱导表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达产物占全菌蛋白的３７％以上。Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析和纯化产物的Ｎ端氨基酸序列测定结果都表明上述两种人工全合成ｂＧＨ基因在大肠杆菌中得到了高效表达,表达量为现今国际文献报道的高限水平。     

Localization of An Exogenous GH Gene on Chromosomes of Transgenic Pig by in situ Hybridizaiton

近些年来随着原位杂交技术的不断改进,该技术已广泛用于染色体的基因定位。非放射性标记探针的应用使基因定位变得更加简单易行,从而有可能对动物的转基因进行定位研究。本文首次采用胶体金标记药盒（Ａｎｔｉｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎｇｏｌｄ）和银加强试剂（Ｓｉｌｖｅｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｒｅａｇｅｎｔｓ）的非同位素原位杂交技术对转基因猪外源基因进行了定位研究。如Ｆｉｇ．１所示：表达质粒ｐＳＭＴＰＧＨ含有载体ｐＵＣ１９,羊启动子ＭＴ０１１和猪生长激素ＰＧＨ基因。选５头带有ｐＳＭＴＰＧＨ的转基因猪,分别制备含有染色体ＤＮＡ的杂交膜。用ＢｇｌＩＩ和ＳｍａＩ对ｐＳＭＴＰＧＨ进行完全酶切,收集０．９Ｋｂ片段作为探针,以ｄｉｇ１１ｄＵＴＰ进行标记。探针与ＤＮＡ杂交后,用Ａｎｔｉｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎｇｏｌｄ和Ｓｉｌｖｅｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｒｅａｇｅｎｔｓ进行显色反应。胰酶法Ｇ—显带后,用光学显微镜检查。选择分散相良好、显影银颗粒清楚的玻片进行摄影记录（Ｆｉｇ．２）。对染色体上的显影银颗粒进行统计分析,参照家猪的染色体标准带型,确定外源ＰＧＨ基因整合位点。Ｆｉｇ．３为４１０４号转基因猪染色体上的银颗粒分布情况。对５头     

气道上皮细胞的抗氧化损伤保护及微环境调控

本工作建立了臭氧对原代培养的兔支气管上皮细胞（ＢＥＣ）损伤模型,观察到血管活性肠肽（ＶＩＰ）、表皮生长因子（ＥＧＦ）、热应激等微环境理化因子可减轻细胞损伤,具有细胞保护作用,其保护机制与提高还原谷胱甘肽（ＧＳＨ）含量有关,并依赖于蛋白激酶的磷酸化调节及基因转录。ＢＥＣ细胞在基础情况下有ｂｃｌ－２基因的低水平表达。ＶＩＰ和ＥＧＦ可促进ｂｃｌ－２基因转录,增强ＢＥＣ的抗氧化损伤能力。ＥＧＦ或热应激促进     

Studies on Pattern of Producing Transgenic Fish I.Production and Detection of All fish TRansgenic Common Carp With cMT sGH Gene

转基因鱼工作的开展被用于水产科学基础与应用研究的各个领域。应用方面的一项重要研究就是利用转生长激素基因来提高鱼的增长速度。需要解决两个问题：一是转基因鱼所使用的基因元件;二是外源基因的高整和率与高表达。已有许多报道认为：不同种动物的生长激素不一定相互促进生长。我们通过显微注射,将鲤鱼金属硫蛋白启动子（ｃＭＴ）与大马哈鱼生长激素基因（ｓＧＨ）的融合基因（ｃＭＴｓＧＨ）导入鲤鱼单细胞后期的早期胚胎,构建了全鱼转基因鲤鱼。通过斑点杂交、Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ结合ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ,对外源ｓＧＨ的整和进行了精确的检测和分析。实验选取性成熟鲤鱼,收集卵子和精子,湿法受精获得受精卵。经过基因注射,孵化后的鱼苗放入水族箱。待鱼苗平游,提取总ＤＮＡ进行检测。以ＰｓｔＩ酶切质粒ｐｃＭＴｃＧＨ（Ｆｉｇ．４）分离３．４ＫｂｓＧＨ片段,用随机引物标记,作为杂交探针。同时,设计并合成ｓＧＨ基因的ＰＣＲ特异引物。Ｆｉｇ．１的斑点杂交结果与Ｆｉｇ．２的ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ结果相比较（Ｔａｂｌｅ１）,说明斑点杂交存在着高的假阳性。而ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ将ＰＣＲ的快速、方便与Ｓｏｕｔｈｅｒｎ的准确性相结合,排除了Ｐ     

香菇的电泳核型分析

采用钳位均匀电场（ＣＨＥＦ）凝胶电泳进行香菇的电泳核型分析,香菇染色体ＤＮＡ呈现８个谱带,结果与香菇联会丝复合物电镜研究一致。以酿酒酵母、裂殖酵母染色体作参照物,香菇染色体大致在７～２．２Ｍｂ之间,染色体组总计约３３Ｍｂ。电泳核型分析也可研究ｒＲＮＡ基因定位。     

牛生长激素释放因子的融合表达及其产物的化学加工

通过寡核苷酸引导的定位突变,在人工全合成的第２７位为Ｉｌｅ的牛生长激素释放因子［Ｉｌｅ２７］ｂＧＲＦ（１－４４）ＯＨ基因的５＇端ＡＴＧ后插入Ｔｒｐ密码子序列,并分别了构建了Ｐｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ控制下、以β－半乳糖苷酶和ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ结合ＩｇＧ ｄｏｍａｉｎＢ、Ｃ为载体蛋白的融合型基因表达质粒ｐＢＬＥ３１０和ｐＢＬＰＡＥ２Ｄ,在大肠杆菌中得到高效表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析,表达产物β－Ｇａｌ     

人生长激素基因的cDNA克隆,原核高效表达及纯化

用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从含有全长人生长激素（ＨＧＨ）基因的ＣＨＯ细胞中获得ｈｇｈ的ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＥＴ－１１ｂ载体中,在大肠杆菌中获得高效表达,表达量占菌体蛋白总量的２０％。经色谱纯化后,纯度大于９５％。     

马铃薯HMGR基因的克隆,序列分析及其表达特征

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,从马铃薯（Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）幼叶中克隆了一个约１．０ｋｂ的ｃＤＮＡ片段,序列分析结果表明,该ｃＤＮＡ与忆报道的马铃薯ＨＭＧＲ基因家族的三种类型基因具有较高核酸序列同源性,与ＨＭＧＲⅠ基因同源性为７７．０％,ＨＭＧＲⅡ基因为９３．２％,ＨＭＧＲⅢ基因为７７．１％。其中３’端非翻译区序列与ＨＭＧＲⅠ、ＨＭＧＲⅡ、ＨＭＧＲⅢ三种基因同源性分别为５０．２％,８     

大麻哈鱼生长激素基因Ⅱ的分子克隆和序列分析

以λ噬菌体ＥＭＢＬ－３为基因载体,构建大麻哈鱼（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ　ｋｅｔａ）基因组文库,并从中分离出含全长的生长激素（ｃｓＧＨ）基因的克隆。本研究首次报道了对ｃｓＧＨ全长核苷酸序列分析的结果。发现ｃｓＧＨ基因由６个外显子和５个内含子组成,长度为３３６１碱基对（ｂｐ）。由该序列可推导出含２１０个氨基酸的多肽,其中存在２２个疏水氨基酸残基的信号肽。本研究所分析的ｃｓＧＨ的外显子和内含子,其排列方式与其他鲑类（Ｓａｌｍｏｎｉｄｓ）和罗非鱼（Ｔｉｌａｐｉａ）是相似的,而与鲤科鱼类（Ｃａｒｐｓ）不同,后者外显子和内含子的排列方式与哺乳类和鸟类相似。将所测定的 ｃｓＧＨ基因的编码区与已发表的 ｃｓＧＨⅡ和ｃｓＧＨ Ⅱ两种 ｃＤＮＡ序列进行比较,证明本研究所克隆的 ｃｓＧＨ基因应属于 ｃｓＧＨ Ⅱ,因它们的编码序列 １００％同源。