来源于西梅的(R)-醇腈酶促立体选择性转氰合成(R)-酮醇腈

在水/有机溶剂双相反应体系中,研究了来源于西梅的(R)-醇腈酶催化酮与丙酮醇腈合成(R)-酮醇腈的立体选择性转氰反应．系统探讨了不同酶源、酶粉颗粒大小、底物浓度、两底物配比、酶浓度和底物结构对转氰反应的影响．结果发现西梅醇腈酶能高效催化三甲基硅酮与丙酮醇腈的立体选择性转氰．酶粉颗粒大小以直径0.3～0.45 mm为优,底物浓度以21 mmol/L左右为佳,底物丙酮醇腈与三甲基硅酮摩尔浓度比以2∶1为宜,酶浓度以60.9 g/L左右为好．西梅醇腈酶对3, 3-二甲基-2-丁酮几乎没有催化活性,而对其硅结构类似物三甲基硅酮却具有非常高的立体选择性和催化活性,在上述优化反应条件下反应24 h的底物转化率和产物光学纯度均高达99%以上,表明底物中的硅原子对西梅醇腈酶的催化活性有非常显著的促进作用．     

一类生物催化剂——氰基耐受型腈水合酶

氰基耐受型腈水合酶是一类生物催化剂。与普通腈水合酶相比,它能够耐受体系中较高浓度的氰基而不受抑制,从而为α-羟(氨)基酰胺的工业化合成开辟了崭新途径。研究腈水合酶的氰基耐受性机理及提高其耐受能力是目前需要解决的关键问题。综述了腈水合酶受氰基抑制的机制,氰基耐受型腈水合酶的发现以及其在蛋氨酸和2-羟基异丁酰胺生物合成中的应用。同时,对今后氰基耐受型腈水合酶基础、应用研究的思路进行了探讨。     

腈类物降解菌多样性和产腈水合酶研究进展

腈水合酶催化反应在有机合成领域已有广泛的应用。作为一类重要的催化剂,腈水合酶可以将腈类物质转化为相应的酰胺。由于这种酶具有固有的立体和区域选择性,在精细化工领域已成为绿色、温和、对同分异构体具有选择性的催化剂。同时腈水合酶在生物修复和环境保护中也起着重要作用。综述了目前国内外腈水合酶的研究进展,包括降解腈类的微生物多样性、腈水合酶的催化特性、产腈水合酶菌株的改造以及腈水合酶相关基因的克隆与研究。对固定化酶和腈水合酶的应用也进行了叙述。     

棒状杆菌腈水合酶的形成条件

本文研究了棒状杆菌(cORYNEBACTERIUM)ZBB-2l腈水合酶形成的最适条件。在培养基中加入Fe2+、维生素B1和L-谷氨酸等,并以n-丁腈做诱导物,可明显促进该菌腈水合酶的生物合成。ZBB-21菌在选定的培养基中,于28℃培养64小时,其腈水合酶比活力可达83．1u／mg,而酰胺酶的比活力只有1．1u／mg。腈水合酶比活力比以前报道的提高9倍。     

诺卡氏菌腈水合酶基因在重组毕赤酵母中的表达

为从基因水平上改造腈水合酶,进行了诺卡氏菌腈水合酶基因的外源表达研究。在重组大肠杆菌表达系统内,腈水合酶的α亚基几乎不能正常表达,在重组E. coli BL21(DE3) (pET32aNHBAX)中,腈水合酶活性仅为0.04U/mg。构建重组毕赤酵母表达质粒pPIC3.5kNHBAX,采用电穿孔转化法将其转入宿主菌P. pastoris GS115中,经过菌株培养和腈水合酶的诱导表达,筛选获得了优选菌株P. pastoris NH4。对P. pastoris NH4的细胞培养和腈水合酶的诱导表达条件进行优化,结果表明,重组腈水合酶在毕赤酵母中的表达水平可以达到0.52U/mg,但不能稳定积累。     

微水相中杏仁醇腈酶催化不对称合成(R)-氰醇的研究

利用气相色谱手性分析,研究了微水相中来源于杏仁的(R)-醇腈酶催化醛与HCN不对称合成(R)-氰醇.结果表明,反应时间、添加乙酸、反应介质、反应体系水活度、反应温度和底物的结构对醇腈酶反应均有显著影响.杏仁醇腈酶对芳香族、脂肪族和杂环族醛均有良好的催化作用.其中,苯甲醛为杏仁醇腈酶的最适作用底物,在低温（0～5℃）下,转化率和产物对映体过剩值均在99%以上.     

腈水合酶基因克隆与调控表达的研究进展

微生物腈水合酶作为新型生物催化剂得到日益广泛的应用 ,但野生菌株本身存在的酶稳定性差等问题制约了这一绿色工艺的发展 ,基因工程菌为解决这个难题开辟了新的思路。总结了各种菌株中腈水合酶的序列研究进展 ,虽然基因序列和蛋白序列同源性不高 ,但它们都以基因簇的形式存在 ,并具有相同的活性中心序列。归纳了克隆并表达腈水合酶基因的基本步骤和方式 ,并提出几种有效增强重组腈水合酶活性表达的方法。     

腈水合酶转化反应的影响因子

棒状杆菌(corynebactcrium sp.)ZBB-21腈水合酶能高效地将丙烯腈转化为丙烯酰胺,其转化反应的最遣PH为8．0,最适转化反应温度为25℃。反应体系中加入微量的K+、Na+、Mg2+和Fe3+对酶的转化反应有明显的促进作用。过量丙烯腈(浓度为0．3mol／L以上)对酶活性有抑制作用,转化产物丙烯酰胺及其结构类似物丙烯酸是腈水合酶的竞争性抑制剂,其抑制常数K．分别为0．06mol／L和0．70mol,L,游离氰离子(CN-)的存在严重抑制丙烯酰胺的形成(K;=1．25 x 10-3mol／L)。     

重组青霉素G酰化酶拆分制备（S）-邻氯苯甘氨酸

对产青霉素G酰化酶的重组枯草芽胞杆菌发酵产酶条件进行优化,确定优化后的发酵条件：可溶性淀粉10g/L、蛋白胨12g/L、酵母粉3g/L、NaCl10g,／L;pH7．5、培养温度37℃、装液量80mL（500mL三角瓶）、培养28h,青霉素G酰化酶的表达水平由最初的7．34U／mL提高至18．23U／mL。以表达青霉素G酰化酶的枯草芽胞杆菌发酵液为酶源,在水相中对映选择性催化N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸制备（S）-邻氯苯甘氨酸,当底物浓度为100mol／L时转化4h,转化率达44．2％。对底物浓度为80mmoL／L反应液中的（S）-邻氯苯甘氨酸进行分离,达到理论收率的94．29％（以N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸的0．5倍摩尔量为理论产率）,e．e．值大于99．9％。170℃条件下,N-苯乙酰-（R）-邻氯苯甘氨酸与苯乙酸共熔消旋为N-苯乙酰-（R,S）-邻氯苯甘氨酸可用于循环拆分。     

用于腈纶表面改性的Corynebacterium nitrilophilus 腈水合酶的摇瓶发酵优化

通过毛细管效应、扫描电镜、染色实验等方法,考察了Corynebacterium nitrilophilus腈水合酶(nitrilre hydratase,NHase)在腈纶表面改性中的应用。结果表明,C. nitrilophilus腈水合酶处理后的腈纶纤维的润湿性及染料可染性分别比对照提高了43.5%和85.7%,说明该腈水合酶具有较好的腈纶纤维表面改性性能。为了提高用于腈纶表面改性的C. nitrilophilus腈水合酶的产量,采用单因素实验及正交实验在摇瓶上对碳源、氮源、诱导剂、金属离子等进行考察,获得较优的摇瓶发酵生产腈水合酶的条件:碳源采用葡萄糖,15 g/L;氮源采用酵母粉与氯化铵复配,浓度分别为3 g/L、1 g/L;诱导剂尿素的最适剂量为10 g/L;由于该腈水合酶是钴型酶,所以需在发酵过程中添加氯化钴,浓度为0.07 g/L。经过摇瓶优化,酶活由最初的16.2 U/ml提高到45.7 U/ml,提高了2.8倍。     

生物催化3-(4-氯苯基)-戊二腈去对称性水解合成光学纯巴氯芬的关键前体

研究了利用生物催化剂制备(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸.以3-(4-氯苯基)-戊二腈为底物,采用苯酚-次氯酸钠法对实验室保藏的菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株赤霉菌Gibberella intermedia WX12,并对其催化特性和发酵条件进行了初步研究.以30 g/L的乳糖和20 g/L的蛋白胨分别为碳、氮源,发酵培养96 h,收集的菌体在50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)中30℃催化反应24 h,将3-(4-氯苯基)-戊二腈转化为4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸,产率为90％.将产物化学转化为巴氯芬,手性HPLC分析表明水解产物构型是(S),其对映异构体过量值ee＞ 99％.该产物可以用来合成光学纯的(R)-和(S)-巴氯芬.     

Determination of 4-(4-chlorophenyl)-4-hydroxypiperidine, a metabolite of haloperidol, by gas chromatography with electron-capture detection

An electron-capture gas chromatographic procedure was developed for the analysis of 4-(4-chlorophenyl)-4-hydroxypiperidine (CPHP), a metabolite of haloperidol. The assay involved basic extraction of this metabolite from the biological samples, followed by back-extraction with HCl. After basification of the acid phase, extractive derivatization with pentafluorobenzoyl chloride in toluene was conducted. The pentafluorobenzoyl derivative was quantified on a gas chromatograph equipped with a fused-silica capillary column, an electron-capture detector and a printer-integrator. N-(3-Trifluoromethylphenyl)piperazine was carried through the procedure as an internal standard and calibration curves were determined for each assay run. The procedure was demonstrated to be linear and reproducible and was utilized to detect and quantify CPHP in urine, plasma, brain and liver samples from rats treated with haloperidol. The structure of the derivatized metabolite was confirmed by gas chromatography-mass spectrometry.     

Bacillus megaterium WZ009催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯

以外消旋4-氯-3-羟基丁酸乙酯为唯一C源的富集培养筛选得到一株菌株WZ009,经16S rDNA测序鉴定为巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)。B.megaterium WZ009静息细胞可以立体选择性催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯水解和脱氯反应得到光学纯的(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(e.e.≥99%)和(S)-3-羟基-γ-丁内酯(e.e.≥95%)。笔者对B.megaterium WZ009不对称催化反应影响因素(温度、pH、中和剂、底物浓度、时间进程以及细胞重复利用)进行优化研究,确定了该反应体系最优条件:底物浓度200 mmol/L,中和剂氨水,pH 7.2,40℃反应12 h,转化率达到50.6%,底物对映体过量值为99.6%。该生物催化合成(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯和(S)-3-羟基-γ-丁内酯过程具有良好的工业化应用前景。     

Monuron metabolism in excised gossypium hirsutum leaves: Aryl hydroxylation and conjugation of 4-chlorophenylurea*

A new glycoside was isolated as a minor metabolite in excised cotton leaves treated with either [carbonyl-¹⁴C] or [ring-¹⁴C] 3-(4-chlorophenyl)-1-methylurea and 4-chlorophenylurea. The aglycone from β-glucosidase or hesperidinase hydrolysis was identified as 4-chloro-2-hydroxyphenylurea by TLC, radioisotope dilution and MS.     

中国红参化学成分的研究(Ⅱ)

目的:研究五加科人参属常用中药红参的化学成分。方法:采用硅胶柱层析、反相柱层析、Sephadex LH-20柱层析、半制备液相色谱等方法分离纯化,根据理化性质和波谱数据鉴定化合物的结构。结果:从红参中分离并鉴定5个化合物,结构分别为:异麦芽酚甘露糖苷(isomaltol-3-α-D-O-mannopyranoside 1),人参皂苷Rc(2),麦芽酚(3),β-谷甾醇(4),棕榈酸(5)。结论:化合物1为首次从五加科中分离得到。     

β-环糊精对甾体微生物羟化反应的影响

考察了β-环糊精(β-cyclodextrin, CD)对雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3,17-diorle,AD)在水中的溶解度及微生物对其11а羟化反应的影响,结果表明β-环糊精能显著提高底物AD在发酵培养基中的溶解度,增溶效果优于有机溶剂.在底物投料浓度0.2%(w/v)时,与4%无...     

山木通的化学成分研究

目的：对毛茛科铁线莲属植物山木通的化学成分进行提取、分离和鉴定。方法：用不同浓度乙醇提取,利用硅胶、SephadexLH-20、ODS柱色谱法对山木通的化学成分进行分离,根据理化性质和MS、NMR光谱数据进行结构鉴定。结果：经鉴定得到7个化合物,分别为β-谷甾醇（Ⅰ）;正二十二烷（Ⅱ）;3-羰基齐墩果烷（Ⅲ）;正十六烷酸（Ⅳ）;正二十六烷酸（Ⅴ）;丁香酸（Ⅵ）;5-羟基4-氧代戊酸（Ⅶ）。结论：所得化合物均为首次从该种植物中得到。     

Functional expression of nitrile hydratase in Escherichia coli: requirement of a nitrile hydratase activator and post-translational modification of a ligand cysteine

The nitrile hydratase (NHase) from Rhodococcus sp. N-771 is a photoreactive enzyme that is inactivated on nitrosylation of the non-heme iron center and activated on photo-dissociation of nitric oxide (NO). The nitrile hydratase operon consists of six genes encoding NHase regulator 2, NHase regulator 1, amidase, NHase alpha subunit, NHase beta subunit and NHase activator. We overproduced the NHase in Escherichia coli using a T7 expression system. The NHase was functionally expressed in E. coli only when the NHase activator encoded downstream of the beta subunit gene was co-expressed and the transformant was grown at 30 degrees C or less. A ligand cysteine, alphaCys112, of the recombinant NHase was also post-translationally modified to a cysteine-sulfinic acid similar to for the native NHase. Although another modification of alphaCys114 could not be identified because of the instability under acidic conditions, the recombinant NHase could be reversibly inactivated by nitric oxide.     

血浆(1-3)-β-D-葡聚糖诊断深部真菌感染的临床研究

目的探讨血浆(1-3)-β-D-葡聚糖对早期诊断深部真菌感染的临床价值。方法收集2009年3月～11月间在北京友谊医院感染科住院患者174例,根据侵袭性真菌感染诊断标准,将患者分为排除深部真菌组、确诊组、临床诊断组、拟诊组。应用MB-80微生物动态快速检测系统,检测各组患者血浆(1-3)-β-D-葡聚糖水平,分析比较深部真菌感染组和非深部真菌感染组血浆(1-3)-β-D-葡聚糖的水平。结果深部真菌感染组血清(1-3)-β-D-葡聚糖含量为(153.4±37.0)pg/mL,排除深部真菌感染组血清(1-3)-β-D-葡聚糖含量为(54.6±8.6)pg/mL,两组间有统计学差异(t=3.4,P<0.01);分析血浆(1-3)-β-D-葡聚糖诊断深部真菌感染,以20 pg/mL为诊断阈值,其准确率、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为70.1%、87.5%、61.9%、52.1%、91.2%。确诊病例、临床诊断病例、拟诊病例,3组间血清(1-3)-β-D-葡聚糖含量无统计学差异(P>0.05)。结论深部真菌感染组的葡聚糖水平明显高于排除深部真菌感染组的葡聚糖水平,具有统计学意义。以20 pg/mL为诊断阈值,其准确率、敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值分别为70.1%、87.5%、61.9%、52.1%、91.2%,可作为深部真菌感染的最佳诊断阈值。     

日本血吸虫重组信号蛋白14—3—3的纯化及单克隆抗体的制备

纯化日本血吸虫（中国大陆株）重组信号蛋白（rSj14—3—3）,并制备其单克隆抗体。以纯化后的rsj14-3—3蛋白为抗原免疫Balb／c小鼠,用杂交瘤技术制备抗rSj14-3-3的单克隆抗体,并通过ELISA方法和Westernblotting测定抗体的效价与特异性。获得了大量高纯度的rSj14-3-3蛋白：筛选出了能够稳定分泌抗rSj14．3．3单抗的杂交瘤细胞株3H6。单抗亚型为IgG1。实验依靠大肠杆菌表达系统高效表达了rSj14—3—3蛋白,并利用该蛋白制备了单克隆抗体．可用于今后血吸虫病免疫诊断的实验研究。