川芎嗪对转化生长因子β1刺激肝星状细胞CTGF及I型胶原表达的影响

研究川芎嗪对大鼠肝星状细胞株（hepatic stellate cell—T6,HSC—T6）结缔组织生长因子CTGF（connec tivetissue growth factor）及I型胶原表达的影响．培养HSC—T6细胞,不同浓度川芎嗪与转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-βl）刺激的HSC—T6共同孵育．用MTT（3-（4,5-Dimethyhhiazol-2-yl）-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法检测HSC-T6增殖：免疫细胞化学法观察川芎嗪对CTGF表达的影响;Western印迹法检测CTGF蛋白的表达．ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）法测定I型胶原表达．结果表明,一定浓度（100、200、400、600mg／L）川芎嗪能抑制HSC—T6增殖,且呈剂量依赖性．免疫细胞化学结果显示随着川芎嗪浓度的升高,CTGF表达依次递减,与正常对照纽比较,具有显著性差异（t=4．216,P〈0．01）．川芎嗪还可以明显抑制CTGF蛋白的表达,并可抑制I型胶原合成,二者抑制程度呈正相关关系（r=0．861,P〈0．01）．川芎嗪可能通过抑制HSC—T6细胞增殖,下调CTGF的表达,阻断I型胶原合成,从而发挥其抗肝纤维化的作用．     

转化生长因子-β1通过促进结缔组织生长因子表达抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖

目的:研究转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对人胰腺癌细胞系PANC-1增殖的影响。方法:首先利用MTT检测重组TGF-β1、CTGF及anti-CTGF抗体处理PANC-1细胞后,细胞的增殖状态,用流式细胞仪(Flow cytometer,FCM)检测转染pcDNA3.1(-)-CTGF后PANC-1细胞的凋亡情况,最后利用RT-PCR检测TGF-β1作用PANC-1细胞后CTGF mRNA的表达。结果:TGF-β1和CTGF均呈浓度依赖性抑制PANC-1细胞增殖,加入anti-CTGF抗体可以取消TGF-β1对PANC-1细胞增殖的抑制作用;FCM结果显示pcDNA3.1(-)-CTGF质粒转染促进PANC-1细胞凋亡;RT-PCR则证明TGF-β1促进PANC-1细胞中CTGF mRNA表达。结论:TGF-β1可能通过促进CTGF表达来发挥抑制胰腺癌细胞PANC-1增殖的作用。     

siRNA对肝纤维化的抑制作用

目的:研究肝星状细胞(HSC)中smad2特异性小干扰RNA(siRNA)对Ⅰ型胶原表达的抑制作用,探讨抗肝纤维化的基因治疗新方法。方法:设计合成靶向Smad2基因的siRNA,将筛选成功的siRNA瞬时转染入体外培养的肝星状细胞(HSC),并给予转化生长因子β(TGF-β)刺激,应用RT-PCR和Western blot技术检测对照组与实验组Ⅰ型胶原mRNA水平和蛋白水平表达差异,研究siRNA对Ⅰ型胶原表达的抑制作用。结果:siRNA能明显降低肝星状细胞中Smad2的RNA和蛋白的表达水平,证实筛选的siRNA有效,能特异性抑制Smad2的基因表达;TGF-β刺激肝星状细胞后,与对照组比较,siRNA转染组细胞外基质(ECM)成分Ⅰ型胶原的表达水平明显降低(P<0.05)。结论:siRNA能够抑制TGFβ对肝星状细胞的激活,阻断TGFβ-Smads传导通路,使Ⅰ型胶原分泌下调,有效抑制TGFβ诱导的肝纤维化。     

HSC的活化、增殖与TGF-β1及其Ⅰ型受体在中晚期纤维化肝组织中的改变及护杆片对其的影响

目的 探讨护肝片对中、晚期纤维化大鼠肝组织肝星状细胞(HSC)的活化与增殖及转化生长因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)表达的影响.方法 采用12.5% CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,自造模之日起,大鼠分组灌胃给药(护肝片921mg·kg-1)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分别处死动物,取左叶肝组织石蜡包埋,制作组织芯片,免疫组化S-P法检测大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TGF-β1及TβRⅠ蛋白的表达,并用MetaMorph图像分析系统计数α-SMA阳性细胞数、对TGF-β1及TβRⅠ蛋白表达量进行定量分析.结果 1.模型复制8周和13周,模型组的肝损伤及其纤维化分级均明显高于正常组(P＜0.01),护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组.2.模型复制8周和13周,模型组活化的HSC(即α-SMA阳性细胞)数量较正常组明显增多、TGF-β1及TβRⅠ蛋白的表达较正常组明显增强(P＜0.01);3.护肝片显著抑制8、13周纤维化肝组织HSC的活化与增殖和TGF-β1及TβRⅠ蛋白的表达(P＜0.01).结论 抑制HSC的活化与增殖和TGF-β1及TβRⅠ的表达可能是护肝片抗肝纤维化作用的靶点之一.     

结缔组织生长因子在肺纤维化初期肺动脉中的表达

本研究观察了博莱霉素(bleomycin,BLM)诱导肺纤维化初期肺动脉压、肺动脉壁Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量以及肺动脉壁结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)免疫阳性表达和分布.用气管内一次性滴注BLM(5 mg/kg体重)的方法复制肺纤维化动物模型大鼠;用右心漂浮导管技术检测肺动脉压;用天狼星红胶原纤维特异染色和偏振光观察肺动脉Ⅰ、Ⅲ型胶原;用免疫组织化学法检测肺动脉壁CTGF表达.结果显示:滴注BLM后第14天,大鼠肺动脉压高于对照组大鼠(P<0.05);肺动脉主干和肺内动脉壁Ⅰ、Ⅲ型胶原的染色面积大于对照组大鼠(P<0.05,P<0.01),肺动脉主干血管壁Ⅰ、Ⅲ型胶原染色面积的比值高于对照组大鼠(P<0.05);肺动脉主干和肺内动脉壁CTGF免疫染色面积均大于对照组大鼠,平均光密度也高于对照组大鼠(均P<0.05);增多的CTGF免疫阳性细胞主要分布在肺动脉的平滑肌层和内皮层.以上结果表明,在BLM致肺纤维化形成初期肺动脉高压和肺血管壁结构重塑过程中,肺动脉壁平滑肌层和内皮层CTGF表达增多,这可能是肺动脉高压维持和发展的机制之一.     

抵抗素对NAFLD肝纤维化的影响及可能的体内外机制

应用高脂饮食饲养Wistar大鼠建立非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)肝纤维化体内模型,选用重组抵抗素作用于肝星状细胞(hepatic stellate cell-t6,HSC-T6)建立体外模型。观察肝组织纤维化的情况;检测体内体外Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(CIV)、层黏蛋白(LN)水平;检测肝组织抵抗素mRNA和蛋白的表达水平;检测HSC-T6中转化生长因子β-1(TGF-β1)mRNA及肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达水平。结果显示,随着高脂喂养时间的延长,大鼠肝组织抵抗表达逐渐增加且纤维化程度逐渐加重;随着抵抗素浓度的增加,HSC-T6上清中纤维化指标升高,细胞中TGF-β1mRNA及TNF-αmRNA表达增加。与对照组比较,各指标差异均有显著性(P<0.05或0.01)。上述结果显示抵抗素通过TNF-α、TGF-β1诱导NAFLD肝纤维的发生和发展。     

补骨脂素对肝星状细胞(HSC-T6)增殖、氧化应激及Ⅰ型胶原分泌的影响

通过研究植物雌激素香豆素补骨脂素对体外培养的大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖及相关因子表达的影响,为补骨脂素治疗肝纤维化提供实验依据。常规培养肝星状细胞HSC-T6,采用0.1 mmol/L的H2O2制造HSC-T6氧化应激的模型。分别用MTT法检测肝星状细胞增殖、放射免疫法检测细胞上清液中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),还原性谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性和含量,ELISA法测定Ⅰ型胶原的分泌。结果表明:与正常对照组组比较,补骨脂素在浓度为10μmol/L,1μmol/L,0.1μmol/L,均呈现出抑制HSC-T6增殖的作用(P<0.05),且最佳作用时间为48 h(P<0.05);与模型组比较,补骨脂素各个浓度组能够提高SOD和GSH-Px的活性(P<0.05),并降低细胞上清液中MDA和GSH的含量(P<0.05);与模型组比较,补骨脂素各个浓度组在作用48 h后,细胞上清液中的Ⅰ型胶原的表达量均降低(P<0.05)。因此,作为植物雌激素的一种,补骨脂素能有效的抑制HSC-T6的增殖及抗HSC-T6氧化应激,很可能成为雌激素的替代品在治疗肝纤维化中。     

结缔组织生长因子基因RNA干扰复制缺陷型腺病毒载体的构建及鉴定

目的：构建能介导结缔组织生长因子（CTGF）基因RNA干扰的复制缺陷型腺病毒表达载体。方法：以大鼠CTGF基因为靶序列,设计并合成含编码短发夹RNA序列的寡核苷酸,构建腺病毒穿梭质粒P-shuttle-CTGF,酶切及测序分析正确后,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转染AD-293细胞,进行病毒包装,得到腺病毒载体Ad．H1-CTGF,用该载体感染HSC-T6细胞,观察其对CTGF基因表达抑制的效果。结果：构建的腺病毒穿梭质粒p-shuttle-CTGF经酶切、测序分析证实正确;包装的病毒载体滴度为4×1010PFU／mL,感染HSC-T6细胞后,Western印迹证实CTGF表达显著减少。结论：构建的腺病毒载体Ad．H1-CTGF可有效抑制HSC-T6中CTGF的表达,为抗纤维化研究提供了有力的工具。     

肝组织中NF-κB、TGF-β1及其Ⅰ型受体mRNA和HSC在肝纤维化中的改变及护肝片对其的影响

目的探讨中、晚期纤维化大鼠肝组织中肝星状细胞(HSC)的活化与增殖、核转录因子-κB(NF-κB)及转化生长因子-β1(TGF-β1)及其Ⅰ型受体(TβRⅠ)表达的改变及护肝片对其的影响。方法采用12.5%CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,自造模之日起,大鼠分组灌胃给药(护肝片921mg/kg)或溶媒,每日一次,直至8或13周末,分别处死动物,取左叶肝组织石蜡包埋,制作组织芯片。免疫组化S-P法检测大鼠肝组织α-平滑肌肌动蛋白(-αSMA)和NF-κB p65蛋白的表达,原位杂交检测TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达;并用MetaMorph图像分析系统计数-αSMA阳性细胞数,对NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达量进行定量分析。结果 1.模型复制8周和13周,模型组的肝损伤及其纤维化分级均明显高于正常组(P<0.01),护肝片组的肝损伤及其纤维化分级均轻于模型组。2.模型复制8周和13周,模型组活化的HSC(即-αSMA阳性细胞)数量较正常组明显增多,NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达均较正常组明显增强(P<0.01);3.护肝片显著抑制8、13周纤维化肝组织HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白、TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达(P<0.01)。结论抑制HSC的活化与增殖和NF-κB p65蛋白与TGF-β1及TβRⅠmRNA的表达可能是护肝片抗肝纤维化作用的靶点之一。     

TGF-β诱导CTGF表达的信号转导途径及与纤维化形成

转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一种具有多重生物学效应的细胞因子,参与了多种组织器官纤维化的形成。结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)是一种富含半胱氨酸的多肽,是介导TGF-β致纤维化作用的重要下游因子之一。TGF-β可通过多种信号途径诱导CTGF表达,本文就这一领域的研究进展及与纤维化形成的关系做一简要综述。