一种多基因串联共表达载体的构建

为了构建一种可用于串联共表达多个基因的原核表达载体,通过PCR引入点突变,对商业载体pET-22b的酶切位点进行定向改造,设计独特的XbaⅠ/SpeⅠ模块。获得改造成功的载体pET-m22b,测序结果显示启动子、核糖体结合位点、多克隆位点及终止子均位于XbaⅠ和SpeⅠ两酶切位点间。选取不同来源的基因进行串联组合及表达鉴定,四个基因成功组合于同一载体中,表达效果良好,各基因表达效率不受明显影响。研究构建的载体pET-m22b,使多基因的共表达更加便捷,为蛋白复合物的表达与纯化、代谢通路的异源重建及其优化等研究奠定了良好的基础。     

离子通道亚型与其基因共表达的关联研究

离子通道亚型与其基因共表达的关联对研究离子通道功能有重要意义。文章采用主成分分析和模糊C-均值聚类算法对数据进行分析, 将方法应用到人类和小鼠两套表达谱数据, 结果发现离子通道亚型中钾离子通道、钙离子通道、氯离子通道和受体激活型离子通道的表达谱聚类结果与生物学分类有较好的一致性, 体现了离子通道亚型在mRNA水平上的共表达, 并证实了通过离子通道表达谱能很好的对离子通道的功能亚型进行分类。     

通过miRNA基因表达谱的基因共表达网络构建对星形细胞瘤的基因靶标进行预测

星形细胞瘤为浸润性生长肿瘤,生长缓慢,多为隐形症状,难以早期发现。多数肿瘤切除后有复发可能,且复发后肿瘤可演变成间变性星形细胞瘤或多形性胶质母细胞瘤。因此寻找其生物标志物早期诊断,并研究新的治疗方法就十分重要。方法:通过选用GEO数据库的星形细胞瘤miRNA表达谱数据,进行差异分析以及靶基因预测,通过2者共表达网络的构建对筛选出的miRNA的研究价值进行探讨。结果:得出hsa-miR-29b-2-5p;hsa-miR-339-5p与hsa-miR-362-3p3个较为关键的miRNA及与3者关系密切的8个mRNA。结论:通过对8个mRNA在癌症中的作用的讨论,肯定了这3个关键miRNA作为潜在靶点的研究价值。     

基于IRES序列的多基因共表达载体构建

目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和HeLa两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白质免疫印迹实验表明,DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组,并且两种蛋白质表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白质相互作用及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。     

基于集成的共表达网络分析方法研究3种癌症的肿瘤相关模块

在肿瘤/癌旁基因表达数据中,差异表达 (DE,differential expression) 代表各种生物条件下基因表达水平的变化,而差异共表达 (DC,differential co-expression) 代表基因对之间相关系数的变化。单独的DC和DE研究方法已经被广泛应用于人类疾病研究中。但是,目前仍然缺乏有效整合DC和DE的分析方法。文中提出一个新颖的分析框架DC&DEmodule,该框架可以基于共表达模块整合DC和DE的特征,并同时整合多个肿瘤/癌旁表达谱的信息,用以识别与疾病相关的基因共表达模块,包括激活模块 (肿瘤样本中上调且共表达增强) 和失能模块 (肿瘤样本中下调且失去共表达)。将该框架用于分析肝癌、胃癌和结直肠癌各两组微阵列数据,分别得到肝癌、胃癌和结直肠癌的2、5和2个激活模块以及5、5和1个失能模块。富集分析表明与同类方法相比,文中的方法在检测已知的肿瘤相关通路和发现新通路方面均具有更高的灵敏度。然后,进一步从这3种癌症的激活模块中鉴定出17、69和11个模块关键基因,其中包含53个已报道的预后生物标志物以及3个分别与3种癌症存活率显著相关的新预后标志物。基于关键基因训练了3种癌症的随机森林模型,用于区分TCGA(The Cancer Genome Atlas) 和GEO (Gene Expression Omnibus)数据库中的肿瘤和癌旁样本,结果显示其分类的平均准确性达到了93%。三种癌症的比较为不同癌症的共有和组织特异性机制提供了新的见解。一系列评估表明,DC&DEmodule框架能够整合公共数据库中快速积累的表达谱,发现更多疾病中功能失调的生物过程。     

利用表达谱基因芯片筛选溃疡性结肠炎差异表达基因

目的:利用人类全基因组表达谱芯片技术,分析溃疡性结肠炎患者和健康者基因表达谱差异,筛选出溃疡性结肠炎相关基因。方法:采用Trizol法提取8例溃疡性结肠炎患者和8例健康对照者结肠粘膜组织总RNA并纯化,逆转录合成c DNA,利用荧光染料Cy3标记aa UTP,转录合成标记的c RNA,并与Agilent人类全基因组表达谱芯片杂交,扫描荧光信号图像,对芯片原始数据进行归一化处理,利用倍数差异和t检验计算筛选出相关差异表达基因,采用DAVID在线分析系统进行基因的功能注释和关联分析,明确差异基因的生物学功能,并对部分差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证。结果:筛查出溃疡性结肠炎结肠粘膜组织差异表达基因4132个,其中上调基因2004个,下调基因2128个。选取6条差异表达基因进行PCR验证,结果有3条基因表达上调,3条基因表达下调,表达趋势与芯片结果一致。结论:溃疡性结肠炎患者与健康对照者基因表达存在明显差异,分析这些差异表达基因有助于我们探索溃疡性结肠炎的发病机制,为疾病的治疗提供理论依据。     

鸡3种组织中热应激相关基因的表达谱芯片分析

文章以8日龄矮小型黄羽肉雏鸡为材料,以28℃±1℃处理3 h为对照组,40℃±1℃热应激3 h为实验组,采集大脑、肝脏、腿肌3种组织,利用全基因组表达谱芯片检测实验组和对照组各组织的差异表达基因,并结合生物信息学方法分析其功能。研究结果表明：在热应激处理组与对照组中,大脑组织中共有183个显著变化的差异表达探针(变化倍数≥2或≤0.5,q≤0.05),129个有基因注释,39个生物学过程发生了改变,18个生物学通路发生显著改变;肝脏组织中有558个显著改变的探针(变化倍数≥2或≤0.5,q≤0.05),包含339个基因,涉及37个生物学过程,58个生物学通路发生改变;腿肌组织中显著改变的探针有301个(变化倍数≥2或≤0.5,q≤0.05),209个有基因注释,参与了31个生物学过程,51个生物学通路发生改变。3种组织中,获得差异表达探针935个,不同组织具有特异性的表达模式;多种热休克蛋白家族基因被诱导上调表达,抗凋亡过程、钙离子信号通路、MAPK信号通路和多种代谢途径发生改变。文章对鸡的热应激分子机制进行了初步探索,为筛选耐热性相关基因提供了理论依据。     

肝癌相关抗原SMP30重组基因的构建、表达及分子伴侣共表达系统的探索

旨在通过应用基因工程的方法构建、表达和纯化肝癌相关抗原SMP30,研究共表达分子伴侣提高基因工程蛋白表达的可溶性及效率。PCR扩增SMP30 cDNA序列,用基因工程技术构建重组表达质粒,转化E.coliBL21(DE3)pLysS宿主菌。表达蛋白经Ni-NTA亲和柱纯化获得HIS-SMP30融合蛋白;分别将4种表达不同分子伴侣的质粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pTf16)转入E.coliBL21(DE3)中;然后再将重组质粒转入含有分子伴侣质粒的细胞中,进行分子伴侣与重组质粒的共表达,SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量与可溶性分析。经优化表达条件后,目的蛋白以包涵体形式表达,目的蛋白占总蛋白的60%以上;纯化后纯度高达95%以上;诱导共表达后,目的蛋白在上清含量极少,不到总表达目的蛋白的10%。成功构建出高效表达的SMP30重组质粒;加入到诱导表达体系中的4种分子伴侣质粒不能有效的促进可溶性蛋白的表达,pTf16共表达系统能增加目的蛋白表达量。     

一种挖掘关键基因的新方法及其应用(英文)

近来,人们发现从疾病相关基因中寻找关键基因对疾病的诊断和治疗很重要。癌相关基因的网络是根据正常和患病的胶质瘤组织的基因表达谱建立。根据建立的基因网络和CIPHER方法,不同阈值下的正常和患病的胶质瘤表型网络被建立。根据已知的疾病和表型间的关联,另一组正常和患病的胶质瘤表型网络被建立。将两种方法建立的相应的表型网络进行比较,匹配度最大时对应的阈值及基因和表型网络被确定。在此基础上,通过打分方法得到了7个关键基因:DMBT1,ERBB2,NF2,PDGFB,AR,ARAF和TP53。文献查询发现其中5个基因与胶质瘤的形成和发展密切相关。剩下两个基因中的ARAF也间接地参与胶质瘤形成。因此,这两个基因可能在胶质瘤的形成中起重要作用。这一预测仍需要实验验证。     

衰老过程中原癌基因及抑癌基因的表达谱

细胞衰老时增殖能力逐渐减退,实质细胞不断减少,是脏器功能衰退的原因之一。原癌基因及抑癌基因与细胞增殖调控密切相关,因而它们与细胞衰老的关系早已引起人们的关注。本文就此进行了概括介绍。总的看来,衰老时多数原癌基因表达降低,抑癌基因表达增强,但亦因细胞的类型而有所差异。     

scLink: Inferring Sparse Gene Co-expression Networks from Single-cell Expression Data

A system-level understanding of the regulation and coordination mechanisms of gene expression is essential for studying the complexity of biological processes in health and disease. With the rapid development of single-cell RNA sequencing technologies, it is now possible to investigate gene interactions in a cell type-specific manner. Here we propose the scLink method, which uses statistical network modeling to understand the co-expression relationships among genes and construct sparse gene co-expression networks from single-cell gene expression data. We use both simulation and real data studies to demonstrate the advantages of scLink and its ability to improve single-cell gene network analysis. The scLink R package is available at https://github.com/Vivianstats/scLink.     

拟南芥花药基因的共表达分析

运用图论中最大团算法,对ATTED-Ⅱ数据库中提供的拟南芥共表达数据进行分析,为进一步研究基因功能提供了较为可靠的数据。文中提出的算法首先根据芯片数据鉴定拟南芥花药基因,然后以ATTED-Ⅱ数据库为基础构建每一个花药基因的共表达网络,最后利用最大团算法从共表达网络中挖掘共表达数据。基于这种方法,系统地分析了每一个拟南芥花药基因的共表达情况,有助于拟南芥花药发育分子机理和基因转录调控的深入研究。实验验证这种方法对拟南芥花药共表达基因的提取十分有效。     

榕小蜂基因共表达研究

榕小蜂的雌雄个体之间存在很大表型差异,以至于很难将雌雄个体彼此联系在一起.以对叶榕传粉榕小蜂作为材料,利用"加权基因共表达网络分析"软件(WGCNA),对榕小蜂的基因组和转录组进行分析,结果发现,5个基因共表达模块,分别用蓝色、蓝绿色、棕色、绿色和黄色标识,其中2个模块偏爱在雌蜂中表达,3个模块偏爱在蛹中表达.基因本体(GO)分析发现在蓝绿色和黄色表达模块中发现3个功能富集的基因集合.在蓝绿色基因表达模块中发现2个基因集合,分别与细胞周期和核苷酸结合活性有关;在黄色基因表达模块中发现1个基因结合,与细胞分化有关,尤其是与神经发育有关.     

A Latent Model to Detect Multiple Clusters of Varying Sizes

Summary This article develops a latent model and likelihood‐based inference to detect temporal clustering of events. The model mimics typical processes generating the observed data. We apply model selection techniques to determine the number of clusters, and develop likelihood inference and a Monte Carlo expectation–maximization algorithm to estimate model parameters, detect clusters, and identify cluster locations. Our method differs from the classical scan statistic in that we can simultaneously detect multiple clusters of varying sizes. We illustrate the methodology with two real data applications and evaluate its efficiency through simulation studies. For the typical data‐generating process, our methodology is more efficient than a competing procedure that relies on least squares.     

cDNA芯片差异表达基因检测的非转换方法

cDNA微阵列数据中包含许多变异因素,用于检测差异表达基因和其它统计分析前,必须将这些“噪音”剔除。对数比法（背景校正、对数比转换和数据标准化）已经被广泛应用于cDNA微阵列数据分析中,然而这种方法却存在着一些亟待解决的缺陷。对此,该文提出一种非转换方法,它可免去对数比的转化过程,直接在背景校正后进行数据标准化,可以有效剔除实验“噪音”。研究结果表明：在检测差异表达基因的效率方面,非转换方法比常规的对数比法具有更好的稳健性和更高的检测功效,基因检出率和准确性大大提高。     

A Non-transformation Method for Identifying Differentially Expressed Genes from cDNA Microarrays

cDNA microarray data are subject to many sources of variation that have to be removed before statistical tests can be applied for identifying genes that are expressed differentially. Background correction, log-ratio transformation, and normalization, referred as the log-ratio approach, have been widely used for this purpose. However, there are some problems associated with this procedure. In this study, we proposed an alternative approach that obviates the log-ratio transformation step and goes directly to normalization after background correction. The method can estimate the “noise” effect by utilizing the information more effectively. Simulation studies were carried out to compare the feasibility and efficiency of this approach for detecting the specifically and differentially expressed genes under various conditions with the log-ratio approach. The results showed that our approach worked well and was more robust and powerful than the log-ratio approach.     

多重PCR方法检测霍乱弧菌的研究

霍乱弧菌是霍乱的病原体,可以分为O1群、O139群和非O1/非O139群。O1群和O139群霍乱弧菌产生的霍乱肠毒素(也称霍乱毒素)是产生霍乱的主要原因,也只有O1群和O139群霍乱弧菌可引起霍乱。其他群的霍乱弧菌毒性不高,但在食品中也不允许被检出。实验以霍乱胶原酶基因和霍乱毒素基因为目的基因,试图建立一种PCR方法对霍乱弧菌进行检测研究,结果表明此方法可以用于食品中的霍乱弧菌检测。     

Co-expression of a Modified Maize Ribosome-inactivating Protein and a Rice Basic Chitinase Gene in Transgenic Rice Plants Confers Enhanced Resistance to Sheath Blight

Chitinases, -1,3-glucanases, and ribosome-inactivating proteins are reported to have antifungal activity in plants. With the aim of producing fungus-resistant transgenic plants, we co-expressed a modified maize ribosome-inactivating protein gene, MOD1, and a rice basic chitinase gene, RCH10, in transgenic rice plants. A construct containing MOD1 and RCH10 under the control of the rice rbcS and Act1 promoters, respectively, was co-transformed with a plasmid containing the herbicide-resistance gene bar as a selection marker into rice by particle bombardment. Several transformants analyzed by genomic Southern-blot hybridization demonstrated integration of multiple copies of the foreign gene into rice chromosomes. Immunoblot experiments showed that MOD1 formed approximately 0.5% of the total soluble protein in transgenic leaves. RCH10 expression was examined using the native polyacrylamide-overlay gel method, and high RCH10 activity was observed in leaf tissues where endogenous RCH10 is not expressed. R₁ plants were analyzed in a similar way, and the Southern-blot patterns and levels of transgene expression remained the same as in the parental line. Analysis of the response of R₂ plants to three fungal pathogens of rice, Rhizoctonia solani, Bipolaris oryzae, and Magnaporthe grisea, indicated statistically significant symptom reduction only in the case of R. solani (sheath blight). The increased resistance co-segregated with herbicide tolerance, reflecting a correlation between the resistance phenotype and transgene expression.     

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis^1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.