海因酶的催化特性及其反应机理*

目前,已发现多种水解海因类的酰胺酶,如D-海因酶、二氢嘧啶酶、尿囊素酶、亚酰胺酶等海因酶。海因酶具有底物依赖的对映体选择性。在金属离子的参与下,它催化海因、5’-单替代海因及其衍生物发生水解。海因酶是有重要应用价值的工业酶,被广泛应用于生产具光学活性的D-和L-型氨基酸。综述了海因酶的催化特性、反应机理及应用前景。     

海因酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究进展

D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)主要用于合成β-内酰胺类半合成抗生素,是国内最紧缺的医药中间体之一。微生物酶法是目前获得光学纯D-HPG的重要途径,微生物中起催化作用的主要是D-海因酶和N-氨甲酰水解酶。文章综述了产酶微生物的来源,酶的理化性质,以及培养条件的优化、基因工程、酶的固定化技术生产D-HPG的研究进展。     

聚苯乙烯树脂固定化D-海因酶的初步研究

D-海因酶广泛用于D-氨基酸的制备研究和生产中,目前已有许多固定化D-海因酶及含D-海因酶细胞的研究报道。尝试了不同功能基团的聚苯乙烯树脂进行D-海因酶的固定化,结果表明功能基为伯氨基和仲氨基效果较好,并选取聚苯乙烯树脂D92进行了固定化D-海因酶的研究。采用该树脂制备固定化酶的最优条件是：酶质量浓度6mg／mL、温度25℃、固化时间12h。所得固定化酶的最适作用温度45℃,最适作用pH为8.5,且作用温度及适宜pH较广,Km为游离酶的1,8倍,且储存稳定性、操作稳定性较好。45℃下半衰期为11d。     

Eupergit C250L固定化D-海因酶及其催化性质

D-海因酶是海因酶法制备D-氨基酸的关键酶。利用Burkholderic cepecia1003菌发酵产酶,所得海因酶纯化后,以Eupergit C250L为载体进行共价固定化。分别考察了酶液蛋白浓度、固定化时间对蛋白固定量和酶活回收率的影响以及固定化前后海因酶催化性质的变化。结果表明:较高的酶液蛋白浓度和较长的固定化时间均有助于改善海因酶的固定化效果;固定化可显著提高海因酶的最适作用温度,但对其最适作用pH影响不大;固定化后海因酶对D,L-BH和MH的米氏常数均有较大幅度的降低。固定化酶反应器的实验表明:40℃下,底物(D,L-BH)1.0 g.L-1,体积流速1.0 mL.min-1,经21 h转化,产物N-Phe质量浓度可达0.47 g.L-1,转化率达43.21%。     

C-末端残基Arg缺失的D-海因酶的分子形式与稳定性

报道D-海因酶分子C-末端Arg残基的缺失,导致酶的解聚与稳定性的显著改变。用基因克隆、表达与纯化的方法,制备了重组D-海因酶(P479)及其C-末端残基Arg缺失的D-海因酶(P478)。SDS-PAGE和Native-PAGE分析表明,在完全相同的条件下,两者单体的分子量相同;但天然P479为二聚体,而P478为单体并保持约40%催化底物海因的活性。突变酶P478的pH值稳定性显著增加,抗SDS能力亦有所提高,但热稳定性明显降低。结果预示:D-海因酶的C-末端残基Arg显著影响酶的分子形式及热稳定性,虽也影响酶活性,但非酶活性所必需。     

产海因酶的菌种筛选和产酶条件的研究

利用5-苄海因作为唯一氮源法筛选高产海因酶的菌种,从本实验室保存的221株菌种中筛选出12株具有不对称水解5-苄海因生成N-氨甲酰基-苯丙氨酸的菌株,其中假单胞菌（Pseudomonassp.)X4-49具有较高的产酶活力,对此菌的产酶条件的研究表明,产酶的最佳碳源为甘油,最佳氮源为蛋白胨,最佳诱导物为苄海因,尿嘧啶,苄海因作为诱导物的有效浓度为0.2%,产酶的最适培养基的初始pH为7.0。培养条件为33℃,13h。     

恶臭假单胞菌完整细胞的二氢嘧啶酶的性质

由恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)73104产的二氢嘧啶酶对5-苯基海因特异性较高,但也可以水解5-甲硫乙基海因和5-甲基海因;不能水解5-取代基上具有正、负电荷的海因衍生物。酶作用的最适pH因底物不同而有差异,但最适反应温度却相同。 Ag+、Cu2+和Zn2+及金属离子螯合剂对酶活力有强烈抑制作用。将细胞用EDTA处理后约有70％酶活力损失,再加入金属离子,只有Fe2+能将酶活力恢复到原来活力的90％以上,其它金属离子无此作用,证明Fe2+是酶反应所必需的。静息细胞和新鲜细胞在弱酸或弱碱条件下,于40℃以下保温均可使细胞酶活力提高2—3倍,且保温的菌悬液的离心上清液几乎无酶活力;而无细胞提取液保温后无酶活力提高现象,说明在上述条件下,保温可改善细胞膜对底物的通透性,提高酶作用效率。氧能抑制酶反应,主要是因为氧与底物形成可逆结合复合物所致。游离细胞的二氢嘧啶酶对5-苯基海因、5-甲硫乙基海因和5-甲基海因的Km值分别为1.61×10-2、2.08×10-2和1.61×10-2M。     

用底物类似物抗性法选育海因酶高产菌种

以底物类似物抗性作为选择性标记来筛选高产海因酶的突变菌种。假单胞菌(Pscudomonas sp. )J43通过紫外光、亚硝基胍、亚硝基胍加5-氟尿嘧啶三次诱变处理后,测定了161株有5-氟尿嘧啶抗性的突变株的产海因酶活力,得到的突变株M39产海因酶活力比出发株提高了13.7倍。此法对选育其他酶或其催化产物的高产菌种可能也有意义。     

海因酶与氨甲酰水解酶产生菌的鉴定及分布

利用Biolog微生物鉴定系统和16S rDNA序列分析相结合的方法对自行筛选的24株海因酶和氨甲酰水解酶产生菌进行了鉴定。海因酶与氨甲酰水解酶产生菌主要分布在Bacillus,Geobacillus,Brevibacillus,Aneurinibacillus,Microbacterium,Pseudomonas,Kurthia和Empedobacter等菌属,特别的是,Kurthia和Empedobacter是新的海因酶和氨甲酰水解酶产生菌属,说明海因酶和氨甲酰水解酶产生菌在细菌中分布较广泛。进一步分析比较发现,D-海因酶产生菌主要分布于Pseudomonas,Agrobacterium等菌属中,而大部分L-海因酶产生菌分布于Bacillus,Geobacillus,Microbacterium等菌属中,说明D-海因酶产生菌与L-海因酶产生菌分布特点具有一定的种属倾向性。这些工作不仅提供了多种海因酶和N-氨甲酰水解酶的生物材料,而且对双酶的结构与功能及分子进化研究等具有重要意义。     

异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达重组枯草芽孢杆菌的构建

【目的】构建异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的重组枯草芽孢杆菌,探讨其作为全细胞催化剂合成D-对羟基苯甘氨酸的可行性。【方法】采用P_(aco)表达盒表达D-海因酶基因hyd或sd1,采用P_(AE)表达盒表达N-氨甲酰水解酶基因adc。分别以质粒pHP13和pUB110为载体,构建D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达质粒pHCS、pHCY和pUCS。在受体菌中整合表达了acoR和sigL基因,敲除了skf和sdp基因。将共表达质粒分别转化不同的受体菌,通过测定全细胞催化活性,表征D-海因酶和N-氨甲酰水解酶共表达的效果。【结果】带有质粒pHCY和pHCS的重组菌,全细胞催化活性分别为0.21 U/mL和0.31 U/mL。整合表达acoR和sigL基因以及高拷贝质粒pUCS,使全细胞催化活性达到1.0 U/mL。【结论】异源D-海因酶和N-氨甲酰水解酶在枯草芽孢杆菌中能够正确表达。基因拷贝数、acoR和sigL基因表达水平,及skf和sdp基因缺失对重组菌的催化活性具有显著影响。