怀地黄ISSR扩增条件优化的研究

用CTAB法提取怀地黄嫩叶DNA,进行简单重复间序列标记(ISSR)分析.通过单因子实验分别研究了退火温度、Taq酶单位、Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,找出各自的合适条件,而且每一个合适条件确定以后都被作为后续研究的一个条件.通过各个因子的组合研究建立了适宜于怀地黄ISSR分析的扩增体系25 μL PCR反应体积,1×Taq DNA酶缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,0.1% Trion X-100,pH9.0 ),2.5 mmol/L MgCl2,1.5～1.0 U Taq酶,60 ng模板DNA,0.4 μmmol/L引物,各0.4 mmol/L的dATP、dGTP、dCTP和dTTP.合适的退火温度为53～55℃.为用ISSR技术分析鉴定怀地黄种质资源奠定了良好的基础.     

紫云英ISSR引物的筛选及PCR反应体系的优化

以紫云英为研究材料,用哥伦比亚大学(UBC)公布的100条ISSR引物和11种株系紫云英品种的DNA为模板进行PCR扩增,筛选出33条扩增条带较好的ISSR引物,对其中的ISSR引物进行梯度PCR,筛选出最佳的退火温度。再采用正交试验和单因素试验相结合的方法对紫云英ISSR-PCR反应体系的5种因素(模板、Mg2+、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化浓度。确立了适合紫云英的ISSR分析的反应体系。在25μl反应体系中,其反应浓度为:DNA模版50.00ng,Mg2+2.00mol/L,Taq聚合酶1.0 U,dNTP 0.25mmol/L,引物0.20μmol/L,2.5μl 10×buffer。本试验为以后利用ISSR技术进行紫云英遗传多样性分析和物种保护奠定了技术基础。     

野生濒危植物掌叶木的ISSR-PCR反应体系的建立

以野生濒危植物掌叶木的叶片为材料,通过单因子试验分别研究了模板DNA、退火温度、TaqDNA聚合醇用量、dNTP浓度、Mg2+浓度、引物浓度等对ISSR-PCR反应的影响,找出各自的合适条件,通过各个因子的组合研究建立了适宜于掌叶木ISSR分析的扩增体系,即25μL的反应体系中含模板DNA约30ng,Mg2+2.0 mmool/L,引物0.8μmol/L,dNTP0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5U.该研究为利用ISSR分析掌叶木遗传多样性、进行掌叶木种质资源研究等奠定了良好的基础.     

ISSR标记技术及其在遗传多样性研究中的应用

ISSR(Inter-Simple Sequence Repeat)技术是在PCR中直接使用微卫星序列进行DNA扩增的一种DNA分子标记。章主要介绍了ISSR标记的原理、方法、特点及其在遗传多样性研究中的应用。ISSR标记方法具有无需知道任何靶标序列的微卫星背景信息、遗传多态性高、检测快速等特点,在遗传多样性研究中具有广泛的应用前景。     

红松ISSR-PCR 实验系统影响因素

本文探讨了红松(Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) ISSR实验中的各种影响因素,分别对红松的鲜叶、干叶、胚和胚乳4种材料进行了DNA的提取和PCR扩增,证明4种取样方式都是可行的。另外分析了模板的纯度和浓度、dNTP浓度以及TaqDNA聚合酶的浓度等对ISSR-PCR扩增的影响;尝试了不同的退火温度、延伸时间和循环次数, 筛选出17个扩增稳定且多态性丰富的ISSR引物;建立了红松ISSR的最佳反应体系,为进行红松种群间遗传分化的研究奠定基础。     

简单重复序列区间(ISSR)引物反应条件优化与筛选

以豆科沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus)的基因组DNA制备ISSR-PCR模板。通过对聚合酶链式反应（PCR）体系中模板DNA浓度,Mg^2 浓度,dNTP的用量,Taq酶的含量以及退火温度梯度进行试验。探讨筛选出清晰,多态性高,可重复性好的ISSR引物的PCR反应条件,用100个ISSR引物进行了PCR扩增,筛选出效果较好的15个引物,得到121个位点,其中43个多态位点,多态位点比例为36%。     

叉孢苏铁ISSR反应条件的优化及初步应用

利用ISSR 技术对叉孢苏铁(Cycas segmentifida)遗传多样性进行研究,对影响PCR 反应的DNA 模板浓度、dNTP 浓度、Taq 酶含量、引物浓度、Mg2 浓度和退火温度等进行了条件优化。叉孢苏铁的ISSR 最佳反应扩增体系为20μl 反应体积2μl 10 ×PCR buffer,模板DNA20ng,1UTaq 酶,1.5～2.75mmol/L MgCl2,0.1mmol/L 4 ×dNTP,0.22μmol/L 引物,2%甲酰胺。适宜的退火温度为50～52℃。从103 条引物中筛选出12 条用于所有样品的扩增,共扩增出122 条带,其中多态性条带为86 条,占总条带数的70.49%。POPGENE分析结果表明,种级水平上,叉孢苏铁具有中等稍高的遗传多样性水平,且各居群间有着很高的遗传分化度。     

家蚕胚胎细胞系的DNA指纹图谱分析

在建立可靠的家蚕细胞系基因组DNA制备和PCR扩增技术体系的基础上,筛选具有稳定多态性位点的RAPD和ISSR引物,建立家蚕细胞系基因组DNA的ISSR和RAPD分子标记技术体系,检测家蚕细胞系的DNA分子标记多态性,构建细胞系的DNA指纹图谱。筛选出了26个ISSR引物和43个RAPD引物,通过PCR扩增在家蚕胚胎细胞系和传代昆虫细胞系等9个样品中分别获得了797条和1205条多态性条带,多态性达到89．9%和76．6%,不同细胞系的DNA多态性有较大差异,三个家蚕胚胎细胞系具有各自特有的DNA标记。测定了9个样品间的Nei's相似系数和遗传距离,构建了系统发育树,结果表明本实验室建立的3个家蚕胚胎细胞系和家蚕“夏芳×秋白”聚为一簇,亲缘关系较近,而来自不同物种的五个传代昆虫细胞系聚为一簇,它们之间的遗传距离比3个家蚕胚胎细胞系之间的遗传距离更小。     

菠菜性别相关的ISSR标记

菠菜为雌雄异株植物,用CTAB法提取其雌、雄株成株幼嫩叶片DNA,分别构建雌、雄株DNA池,以之为模板,用已优化的ISSR体系扩增,在74条ISSR引物中,I62扩增出一条约1 200 bp雌性连锁标记,回收纯化该特异扩增片段,将其连接于pUCm-T载体,转化进大肠杆菌JM109菌株,并检测及测序。回收克隆和测序后发现该片段全长1 176 bp,富含AT,AT占57.0%。根据测序结果设计1对25 bp的特异引物将这个雌性连锁的ISSR标记转化为稳定性和特异性更好的SCAR标记。该特异引物对随机选取的雌雄菠菜单株进行PCR扩增,在雌株中均有1 176 bp的特异条带,而雄株中均无。此特异条带的获得为菠菜性别相关基因的克隆奠定基础。     

广西甜茶ISSR-PCR反应条件的建立与优化

为了探讨广西甜茶ISSR实验中的多种因素对实验结果的影响,采用单因素法对PCR反应体系中的5个潜在因素(Mg2+, dNTP,引物, Taq酶和模板DNA)在5水平上进行优化实验,并进一步优化了反应程序中的退火温度和循环次数。结果表明：25滋L的最佳反应体系为,1×PCR Buffer、MgCl22.0 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、引物0.8滋mol/L、Taq DNA聚合酶0.75 U、模板DNA 80 ng;最佳反应程序为：在94℃下进行3 min预变性;随后循环扩增35次(包括94℃变性1 min,54℃退火1 min,72℃延伸1 min);最后在72℃下延伸10 min。本研究建立的广西甜茶的最佳ISSR-PCR反应条件为进一步进行遗传多样性研究奠定了基础。     

红松ISSR-PCR实验系统影响因素

本文探讨了红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.)ISSR实验中的各种影响因素,分别对红松的鲜叶、干叶、胚和胚乳4种材料进行了DNA的提取和PCR扩增,证明4种取样方式都是可行的.另外分析了模板的纯度和浓度、dNTP浓度以及TaqDNA聚合酶的浓度等对ISSR-PCR扩增的影响;尝试了不同的退火温度、延伸时间和循环次数,筛选出17个扩增稳定且多态性丰富的ISSR引物;建立了红松ISSR的最佳反应体系,为进行红松种群间遗传分化的研究奠定基础.     

牡丹品种鉴定用ISSR引物的筛选与开发

用于牡丹品种鉴定的DNAISSR-PCR反应体系已经建立。利用DNAISSR分子标记分析少量牡丹品种时,容易获得各品种的特有ISSR标记。然而,中国牡丹品种约有1500个,在小批量品种范围内找到的品种特有ISSR标记有可能出现在其它品种中。因此,利用DNAISSR分子标记对数量庞大的中国牡丹品种进行区分和鉴定时,寻找品种特有标记成为突出的技术难题。标记是由引物通过PCR扩增产生的。因此,关键在于找到理想的ISSR引物。对已知的ISSR引物的筛选未获得良好的PCR扩增结果。报道牡丹鉴定用ISSR引物的设计与开发新途径。     

濒危植物夏蜡梅ISSR扩增条件的优化

为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性,有必要进行ISSR-PCR反应体系的优化。以濒危植物夏蜡梅的基因组DNA为研究对象,利用单因素试验,测试了ISSR-PCR反应体系中镁离子,dNTP,模板DNA含量,Taq DNA聚合酶量、BSA浓度、引物浓度、甘油浓度等7种因素对反应结果的影响,经过优化实验,建立了夏蜡梅ISSR-PCR最佳反应体系：10 μL PCR反应体积,1×Taq酶配套缓冲液（10 mmol·L^-1 Tris·HCl pH9.0,50 mmol·L^-1 KCl, 0.1%Triton X-100）,1.5 mmol·L^-1 MgCl₂,0.75U Taq酶（上海华美公司）,20 ng模板DNA,6pmol引物（上海Sangon公司）;dATP、dCTP 、dGTP 、dTTP 各0.15 mmol·L^-1。利用优化反应体系从100个ISSR引物中共筛选出12个稳定性好、重复性高的引物,对10个居群共200个夏蜡梅个体的DNA进行扩增,共扩增出156个条带,其中多态条带为114个,总的多态位点百分率为73.08%。各居群的多态位点百分率有较大差异,平均为23.65%。夏蜡梅ISSR反应体系的建立为利用ISSR分子标记技术研究夏蜡梅的遗传多样性奠定了良好的基础。     

朝鲜碱茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展朝鲜碱茅种质资源遗传多样性的研究,以野生朝鲜碱茅(Puccinellia chinampoensis)为材料,通过单因子试验对ISSR-PCR反应进行优化。确立最佳的PCR反应体系:在20μL反应体系中,含有模板DNA 40 ng,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,MgCl22.5 mmol/L和10×PCR Buffer(Mg2+free)2μL。此外,还筛选到10条扩增稳定、条带丰富的候选引物,并确定了各自的最佳退火温度。     

Assessment of genetic diversity in dent and popcorn (Zea mays L.) inbred lines using inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification

Popcorn (Zea mays L.) hybrids grown in the United States are derived from narrow-based germplasm, and standard RFLP analysis detects relatively little polymorphism. Inter-simple sequence repeat (ISSR) amplification, a novel technique based on PCR amplification of inter-microsatellite sequences to target multiple loci in the genome, was employed to investigate its potential for detection of polymorphism among nineteen popcorn and eight dent corn inbred lines. ISSR yielded an average of 54 bands/primer/inbred line, with over 98% of the bands repeatable across DNA extractions and separate PCR runs. Ten primers based on di- and tri-nucleotide tandem repeats revealed 73% and 87% polymorphism among popcorn and dent corn lines, respectively, with an overall 95% polymorphism rate. Principal component and cluster analyses resulted in grouping of dent and popcorn lines corresponding to their heterotic breeding pools. ISSR amplification, in addition to being both simple and cost and time efficient, provides for rapid production of highly polymorphic markers which appear to correspond to known pedigree information. Therefore, the ISSR technique may have great potential for identifying polymorphism in species with narrow-based germplasm, and for use in DNA marker-assisted breeding approaches.     

唐古特大黄ISSR-PCR反应条件的优化

利用单因素试验对影响唐古特大黄ISSR-PCR扩增的重要参数进行优化,以期建立其最佳反应条件。结果如下:20μL反应体系包括1.5×PCR buffer(15mmol/LTris-HCl,75mmol/LKCl),1.00mmol/LMgCl2,0.6UTaq DNA聚合酶,0.125mmol/LdNTP,0.5μmol/L引物和30ng模板DNA;引物UBC888适宜的退火温度为57.4℃。ISSR反应条件的建立为利用分子标记技术研究唐古特大黄居群遗传多样性奠定了良好基础。     

Highly informative nature of inter simple sequence repeat (ISSR) sequences amplified using tri- and tetra-nucleotide primers from DNA of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.).

Inter simple sequence repeat (ISSR) sequences as molecular markers can lead to the detection of polymorphism and also be a new approach to the study of SSR distribution and frequency. In this study, ISSR amplification with nonanchored primer was performed in closely related cauliflower lines. Fourty-four different amplified fragments were sequenced. Sequences of PCR products are delimited by the expected motifs and number of repeats, which validates the ISSR nonanchored primer amplification technique. DNA and amino acids homology search between internal sequences and databases (i) show that the majority of the internal regions of ISSR had homologies with known sequences, mainly with genes coding for proteins implicated in DNA interaction or gene expression, which reflected the significance of amplified ISSR sequences and (ii) display long and numerous homologies with the Arabidopsis thaliana genome. ISSR amplifications revealed a high conservation of these sequences between Arabidopsis thaliana and Brassica oleracea var. botrytis. Thirty-four of the 44 ISSRs had one or several perfect or imperfect internal microsatellites. Such distribution indicates the presence in genomes of highly concentrated regions of SSR, or "SSR hot spots." Among the four nonanchored primers used in this study, trinucleotide repeats, and especially (CAA)5, were the most powerful primers for ISSR amplifications regarding the number of amplified bands, level of polymorphism, and their nature.     

SRAP、ISSR技术的优化及在甘蓝类植物种子鉴别中的应用

将SRAP与ISSR 2种分子标记技术应用于8种甘蓝类植物（Brassica oleracea L.）的种子鉴别中。先以甘蓝（Brassica oleracea var. capitata）基因组DNA为模板,通过对SRAP、ISSR反应体系中各影响因素的逐一筛选,优化了甘蓝类植物SRAP、ISSR反应体系。进而采用30个SRAP引物组合和15个ISSR引物对白甘蓝、皱叶甘蓝、红甘蓝、羽衣甘蓝、花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、球茎甘蓝的基因组DNA进行了PCR扩增,结果表明：M3E5与M4E5两个SRAP引物组合可以在8种甘蓝类植物之间显示较高的多态性;844和888两个ISSR引物也可在8种甘蓝类植物之间产生很好的多态,特别是844引物单独应用即可区分所有材料。