糖苷合成酶——— 一类新型的寡糖高效合成工具

寡糖是哺乳动物细胞表面糖蛋白和糖脂以及微生物来源的生理活性物质的要素之一,其应用于医药的巨大潜能至今还没有得到充分体现,主要原因是合成足够于临床使用的寡糖非常困难.传统的化学法和酶法在大规模合成寡糖方面都有一定局限性.近年来,分子生物学技术大大推动了糖苷酶合成寡糖的研究,将糖苷酶催化中心亲核体氨基酸定点突变为非亲核体氨基酸,导致酶的原有水解活性丧失,只催化糖苷键合成反应,寡糖产量最高可达99%,人工产生了一类新酶——糖苷合成酶(glycosynthases),随后又产生了硫代糖苷酶(thioglycoligases)和硫代糖苷合成酶(thioglycosynthases).糖苷合成酶的高通量筛选可用双质粒系统和酵母三杂交系统进行,其活性的进一步改进可通过亲核体氨基酸位点不同氨基酸取代、其他位点氨基酸突变、反应条件优化等方法进行,其区域选择性的改变或增强可通过改变糖基受体分子达到.糖苷合成酶作为一种新型高效的生物催化剂,对寡糖的工业化合成有着重要意义,它的出现对糖生物学的发展必将起到巨大的推动作用.     

植物中棉子糖系列寡糖代谢及其调控关键酶研究进展

棉子糖系列寡糖代谢与植物生长发育、逆境胁迫、种子耐贮性及脱水耐性等关系密切.棉子糖系列寡糖的合成从棉子糖的合成开始,由半乳糖苷肌醇上的半乳糖基的转移依次生成棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖等.寡糖代谢是一个复杂的调控体系,其中肌醇-1-磷酸合成酶、肌醇半乳糖苷合成酶、蔗糖合成酶、棉子糖合成酶、水苏糖合成酶和毛蕊花糖合成酶等参与了棉子糖系列寡糖的生物合成过程.本文对植物中棉子糖系列寡糖的代谢及其重要调控酶的特性、功能及分子生物学研究进展进行综述.     

氟代糖在糖苷酶研究中的应用

近年来,氟代糖应用于糖苷酶反应研究,显示出越来越重要的作用。氟代糖可以作为糖苷酶及其突变酶的水解底物研究酶学性质;氟代糖抑制剂可以标记糖苷酶催化中心,鉴定亲核体氨基酸。尤为重要的是,氟代糖可作为糖苷酶的糖基供体来合成糖类。糖苷酶突变后,可生成糖苷合成酶和硫代糖苷合成酶,可以用与正常底物构型相反的氟代糖作为糖基供体高效合成糖类,收率一般为60%~90%,有的可达100%。糖苷酶及其突变酶以氟代糖为底物高效合成糖类的研究,必将促进生物学、糖生物学和纳米生物材料的发展。     

唾液酸苷酶的催化机理及水解与合成寡糖进展

唾液酸苷酶(EC.3.2.1.18)是一类重要的糖苷水解酶,在动物和微生物中广泛存在.该类酶催化寡糖或糖缀合物上非还原末端唾液酸水解,具有重要的生物学功能,如参与溶酶体降解代谢物、癌症发生、微生物致病等多种生理和病理过程.除了水解活性外,有的唾液酸苷酶还具有转糖基活性,能够以唾液酸单糖或糖苷为糖基供体,催化唾液酸转移到受体分子上,一步合成寡糖和糖苷化合物.这种合成活性对于唾液酸相关糖链的大量获得具有重要意义,有利于推动该类寡糖的基础研究及其在食品和医药中的应用.本文综述了唾液酸苷酶的结构和催化机理、生理功能、转糖基作用及其在寡糖合成中的应用.     

泡核桃肌醇半乳糖苷合成酶基因克隆及表达分析

肌醇半乳糖苷合成酶是植物中棉子糖系列寡糖合成中的关键酶,在植物抗性生理中扮演重要作用。本研究利用RT-PCR技术从泡核桃中成功克隆获得一个受冷害诱导的肌醇半乳糖苷合成酶基因(Js GS1),其含有1 026 bp的开放阅读框,编码341个氨基酸,登录号为:KX657831。该基因推断的蛋白与核桃(Juglans regia)GS蛋白的相似性为89%;系统进化树分析显示其与核桃、麻疯树(Jatropha curcas)、蓖麻(Ricinus communis)形成一个分支。半定量PCR显示:低温4℃处理3 h后有微弱表达,6 h后大量表达。这说明Js GS1是典型的受冷害诱导的GS基因。本研究为揭示泡核桃抗寒机理以及肌醇半乳糖苷合成酶在冷害胁迫下的作用提供帮助,并为利用基因工程手段培育抗寒新品种提供理论依据。     

神经节苷脂氟化寡糖在大肠杆菌中的生物合成

神经节苷脂是一类存在于所有脊椎动物细胞中的糖脂分子,具有重要的生理功能和药用活性。合成生物学为构建神经节苷脂类的人工高效合成体系提供了契机,而其神经节苷脂氟化寡糖中间体的合成是至关重要的步骤。旨在实现神经节苷脂氟化寡糖在大肠杆菌中的人工生物合成途径:通过在大肠杆菌JM107中引入来源于脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)的CMP-NeuAc合成酶(neuA),空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)来源的α2,3-NeuAc转移酶(cst)、β1,4-GalNAc转移酶(cgtA)、β1,3-Gal转移酶(cgtB)和UDP-GlcNAc异构酶(gne),成功构建了以氟化乳糖和唾液酸为底物的3种神经节苷脂GM3、GM2、GM1氟化寡糖在大肠杆菌中的生物合成途径;开发了高灵敏度的氟化寡糖柱前衍生-HPLC定量检测方法 ;并通过对工程菌株进行透酶过表达和启动子优化,在摇瓶发酵中GM3、GM2及GM1氟化寡糖的产量分别达到81.5 mg/L、18.1 mg/L及12.3 mg/L,为进一步的代谢工程改造奠定了良好的基础。     

壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成基因转录的影响

采用RT-PCR方法研究了不同浓度壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成酶基因的转录调控。结果表明, 50 μg.mL-1壳寡糖能够明显诱导烟草悬浮细胞茉莉酸合成途径的关键酶——磷脂酶A2、13-脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物环化酶和12-氧-植物二烯酸还原酶基因的表达, 而且该浓度的壳寡糖对这些基因的诱导作用相同(似)。在实验设定时间内均诱导表达编码磷脂酶A2的基因, 对其它基因的诱导时间均为8小时, 表明50 μg.mL-1壳寡糖在诱抗过程中启动了茉莉酸合成途径。而200 μg.mL-1壳寡糖的处理对这些基因的表达无显著影响。表明不同浓度的壳寡糖对烟草悬浮细胞的作用模式存在差异, 且高浓度的壳寡糖在烟草悬浮细胞中启动的信号通路可能没有茉莉酸信号的参与。     

壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成基因转录的影响

采用RT-PCR方法研究了不同浓度壳寡糖对烟草悬浮细胞茉莉酸合成酶基因的转录调控。结果表明，50μg·mL^-1壳寡糖能够明显诱导烟草悬浮细胞茉莉酸合成途径的关键酶——磷脂酶A2、13-脂氧合酶、丙二烯氧化物合成酶、丙二烯氧化物环化酶和12-氧-植物二烯酸还原酶基因的表达，而且该浓度的壳寡糖对这些基因的诱导作用相同（似）。在实验设定时间内均诱导表达编码磷脂酶A2的基因，对其它基因的诱导时间均为8小时，表明50μg·mL^-1壳寡糖在诱抗过程中启动了茉莉酸合成途径。而200μg·mL^-1壳寡糖的处理对这些基因的表达无显著影响。表明不同浓度的壳寡糖对烟草悬浮细胞的作用模式存在差异，且高浓度的壳寡糖在烟草悬浮细胞中启动的信号通路可能没有茉莉酸信号的参与。     

摘除雌花对甜瓜成熟叶片中糖及相关酶活性的影响

甜瓜有果株的成熟叶片中蔗糖、葡萄糖、果糖含量与无果株的无显著差异,水苏糖与棉子糖含量略低于无果株,肌醇半乳糖苷(合成水苏糖的前体)含量显著低于无果株,蔗糖磷酸合成酶(SPS)和肌醇半乳糖苷合成酶活性与无果株的无显著差异,水苏糖合成酶活性显著高于无果株。     

合成唾液酸乳糖重组大肠杆菌的构建

唾液酸寡糖具有抗感染、提高免疫力、促进双歧杆菌增殖等功能,对其微生物合成方法的研究具有重要的理论和应用价值。克隆和表达来源于Campylobacter jejuni的N-乙酰葡萄糖胺异构酶基因(neuC)、乙酰神经氨酸合成酶基因(neuB)、CMP-乙酰神经氨酸合成酶基因(neuA)和来源于Nesseria meningitidis的唾液酸转移酶基因(nst),利用表达载体pSTV29,在大肠杆菌Escherichia coli JM109内构建合成唾液酸乳糖的代谢途径。在接种量2%、装液量50 mL/250 mL三角瓶、摇床转速180 r/min、温度34℃的条件下发酵30 h,并以10 g/L乳糖为底物,利用HPLC检测到唾液酸乳糖的合成量为2.45 g/L,为人乳唾液酸寡糖及其类似物的异体合成提供了新的思路。