MiR-186-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响研究 *

目的 探究miR-186-5p对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖,分化的影响及其潜在的分子机制.方法: qRT-PCR检测miR-186-5p在不同周龄小鼠白色脂肪组织及3T3-L1前脂肪细胞增殖分化过程中的表达变化;通过脂质体将miR-186-5p mimics,inhibitors转染入增殖液或分化液培养的3T3-L1细胞后,利用CCK-8,EdU和qRT-PCR检测3T3-L1前脂肪细胞增殖变化,油红O染色观察其脂滴形态;通过生物信息软件TargetScan和双荧光报告系统分别对miR-186-5p靶基因进行预测和确认.结果: (1)miR-186-5p在1~6周龄小鼠的白色脂肪组织及3T3-L1前脂肪细胞自然分化过程中表达量均逐渐上调.(2)与阴性对照相比,mimics或inhibitors转染分别显著地促进或抑制了miR-186-5p的表达.(3)过表达miR-186-5p后,3T3-L1前脂肪细胞的增殖速率减慢,脂滴增大增多;而抑制miR-186-5p后,3T3-L1前脂肪细胞增殖速率增快,脂滴数量减少,且粒径变小.其中过表达miR-186-5p显著地降低了野生型Wnt5a和Mapk1 3'-UTR活性,而突变相应的绑定位点可解除该抑制作用.结论: miR-186-5p可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,且通过直接靶向Wnt5a和Mapk1以促进其分化为成熟脂肪细胞.     

3T3-L1前体脂肪细胞分化过程中G蛋白偶联受体48的表达研究

目的 观察G蛋白偶联受体48（GPR48）、过氧化物酶体增殖体激活受体g2（PPARγ2）和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）基因在小鼠胚胎成纤维细胞（3T3-L1）前体脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化,探讨GPR48在脂肪细胞分化过程的作用。方法 体外培养3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,在分化不同时段（第0~14天）,采用Real-timePCR技术检测脂肪细胞中GPR48、PPARγ2和C/EBPα基因信使核糖核酸（mRNA）的表达水平。结果 GPR48基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化第2天和第3天表达显著上调,差异均有统计学意义（t=4.12,P=0.015;t=6.21,P=0.003）,分化第6~14天与分化前表达无差异。PPARγ2表达在诱导分化后明显上调,分化第6天达高峰,第10~14天持续处于较高水平并趋于稳定,与诱导前期相比各时段间表达水平差异均有统计学意义（t在4.17~22.65间,P均〈0.01）。C/EBPα表达在诱导分化后明显上调,分化后第3天达高峰,第6~10天持续保持在较高水平,与诱导前期相比各时段表达水平差异均有统计学意义（t在4.38~13.87间,P均〈0.01）,第14天趋于下调,与分化前比较无差异。GPR48基因表达高峰早于PPARγ2和C/EBPα。结论 在3T3-L1脂肪细胞分化过程中PPARγ2和C/EBPα表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程相一致。GPR48基因表达高峰早于PPARγ2和C/EBPα,可能参与了脂肪细胞分化的早期过程。     

鸡PPARγ基因转录本3上游开放阅读框转录后的调控作用

过氧化物酶体增殖物激活受体γ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)是脂肪生成的关键调控因子。本实验室前期研究发现,与人和鼠等哺乳动物PPARγ基因的转录本不同,鸡PPARγ基因的多个转录本5′UTR区存在上游开放阅读框(upstream open reading frames, uORFs)。为了揭示该uORF转录后的调控作用,本研究构建了鸡PPARγ基因转录本3 (cPPARγ3)野生型5′UTR报告基因载体psiCHECK2-cPPARγ3- 5′UTR-WT和uORF突变(uATG突变为终止密码子TGA)的5′UTR报告基因载体psiCHECK2-cPPARγ3- 5′UTR-Mut。将这两个报告基因载体分别转染永生化鸡前脂肪细胞(immortalized chicken pre-adipocytes, ICPA)和鸡胚成纤维细胞DF1,检测海肾荧光素酶报告基因hRluc活性及其mRNA表达。荧光素酶报告基因检测结果显示,在ICPA细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut的hRluc报告基因活性极显著高于psiCHECK2- cPPARγ3-5′UTR-WT (P<0.01);在DF1细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut的hRluc报告基因活性高于psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-WT,但差异不显著(P>0.05)。qRT-PCR检测hRluc基因mRNA表达结果显示,与psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-WT相比,在ICPA细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut转染细胞的hRluc基因的mRNA表达水平极显著降低(P<0.01);在DF1细胞中,psiCHECK2-cPPARγ3-5′UTR-Mut转染细胞后,hRluc基因的mRNA表达水平也降低,但差异不显著(P>0.05)。为进一步分析该uORF对鸡cPPARγ3的转录后调控作用,本研究又分别构建了野生型cPPARγ3真核表达载体pcDNA3.1-cPPARγ3-WT和uORF突变的cPPARγ3真核表达载体pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut。qRT-PCR检测cPPARγ3的mRNA表达水平,结果显示,在这两种细胞中,pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut转染细胞的cPPARγ3 mRNA表达水平均显著低于pcDNA3.1-cPPARγ3-WT转染细胞(P<0.05),但Western blot结果显示,pcDNA3.1-cPPARγ3-Mut转染细胞的PPARγ蛋白表达水平极显著高于pcDNA3.1-cPPARγ3-WT转染细胞(P<0.01)。这些研究结果表明,5′UTR区的uORF抑制鸡cPPARγ3的翻译。     

促酰化蛋白对脂肪细胞分化中脂滴相关蛋白TIP47表达的影响

研究促酰化蛋白（acylation stimulating protein, ASP）在3T3-L1脂肪细胞分化中对脂滴相关蛋白TIP47(tail-interacting protein 47 kD)表达的影响,从而探讨ASP在成脂方面的重要意义．用免疫荧光染色法观察3T3-L1前脂肪细胞中TIP47的表达定位;采用经典激素鸡尾酒法诱导分化3T3-L1前脂肪细胞,用RT-PCR和Western 印迹方法检测诱导分化的3T3-L1脂肪细胞中TIP47 mRNA和蛋白表达;在分化过程中不同时点,对诱导分化中的3T3-L1脂肪细胞分别给予胰岛素和ASP处理,并设立相应空白对照,用RT-PCR和Western印迹方法检测TIP47 mRNA和蛋白表达． 结果显示,3T3-L1前脂肪细胞中TIP47主要在胞浆内表达;诱导分化过程中的3T3-L1脂肪细胞TIP47 mRNA和蛋白的表达水平呈时间依赖性降低;ASP对诱导分化的3T3-L1脂肪细胞中TIP47 mRNA和蛋白表达有显著的上调作用,但随着分化至48 h,其上调作用已不明显;胰岛素仅在分化的0 d对脂肪细胞中TIP47 mRNA和蛋白表达有上调作用,之后基本无影响．结果提示,ASP促成脂作用可能与其调节脂滴相关蛋白TIP47的表达密切相关,从而为认识及防治肥胖症开拓新的思路．     

miR-196a-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响效应

目的:探究miR-196a-5p对小鼠前体脂肪细胞增殖、分化的影响及其潜在的分子机制。方法:(1)构建小鼠肥胖模型,RT-PCR检测脂肪组织中miR-196a-5p表达量;(2)鸡尾酒法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,RT-PCR检测分化过程中miR-196a-5p的表达变化;(3)合成miR-196a-5p mimics和inhibitors转染3T3-L1细胞,以CCK8、EdU试剂盒检测miR-196a-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响作用;(4)运用油红O染色、甘油三酯测定评估miR-196a-5p对3T3-L1细胞分化的影响;(5) RT-PCR检测miR-196a-5p对前脂肪细胞增殖、分化相关基因的影响;(6)结合前人文献,运用生物信息软件、萤光素酶报告系统对miR-196a-5p调控脂肪细胞分化的靶基因进行筛选和验证。结果:(1) miR-196a-5p在肥胖小鼠脂肪组织中高表达,在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中先升高后下降;(2)与阴性对照组相比,mimics转染抑制了3T3-L1细胞增殖,inhibitors转染促进了3T3-L1细胞增殖;(3)与阴性对照组相比,mimics组积累了大量油红着色的脂滴,甘油三酯含量增多,而inhibitors组的脂滴少而小,甘油三酯含量相对降低;(4)与阴性对照组相比,mimics转染抑制了增殖标志基因Cyclin D1、Cyclin E、CDK2和CDK4表达,促进了分化标志基因PPARγ、C/EBPα、LPL、aP2等的表达,inhibitors转染则表现出与mimics转染相反的作用;(5) miR-196a-5p可显著抑制野生型MAP4K3和MAPK1 3'UTR萤光素酶活性,而突变绑定位点可废除该抑制效应。结论:miR-196a-5p不仅可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,还可促进其诱导分化、沉积脂滴;miR-196a-5p可能通过靶向调节MAP4K3和MAPK1来介导3T3-L1前脂肪细胞分化。     

siRNA沉默Myh3基因抑制C2C12细胞糖酵解

肌球蛋白重链3(myosin heavy chain 3,Myh3)基因为肌肉细胞分化的标志基因,调节肌肉细胞能量的利用,但其是否会影响肌肉细胞不同状态下的糖酵解过程尚鲜有报道。本文以成肌和成脂分化不同阶段的小鼠C2C12细胞为模型,利用qRT-PCR方法研究Myh3与糖酵解相关基因Pkm(M-type pyruvate kinse)、Prkag3(protein kinase adenosine monophosphate-activated γ3-subunit)和Gsk3β(glycogen synthase kinase-3β)的表达模式。发现在C2C12细胞成肌分化过程中,Myh3与糖酵解基因Prkag3和Pkm的相对表达趋势基本一致,都呈现相对表达水平先上升,分化第2 d达到峰值,之后下降的趋势;糖原合酶抑制基因Gsk3β的表达趋势相对平稳。而在C2C12细胞成脂分化过程中,Myh3依然与糖酵解基因Prkag3和Pkm的相对表达趋势基本一致,相对表达量逐渐上升,在分化第8 d达到最高值;糖原合酶抑制基因Gsk3β的表达保持稳定状态。在C2C12细胞成肌分化状态下,qRT-PCR和Western 印迹检测干扰Myh3对细胞糖酵解相关基因Pkm、Prkag3和Gsk3β mRNA和蛋白质表达的影响。结果显示,干扰Myh3后,糖酵解基因Pkm和Prkag3的mRNA表达量极显著降低(P<0.01),糖原合酶抑制基因Gsk3β的mRNA表达无明显变化(P>0.05);Myh3干扰组中Myh3和Pkm的蛋白质水平显著低于空白组和NC组细胞。在C2C12细胞成脂分化状态下,干扰Myh3,糖原合酶抑制基因Gsk3β和糖酵解基因Prkag3的mRNA表达量极显著升高(P<0.01),糖酵解基因Pkm的mRNA表达下降;Myh3干扰组中Myh3和Pkm的蛋白质水平也低于空白组和NC组细胞。综合以上研究,C2C12细胞成肌和成脂状态下糖酵解水平存在明显差异,Myh3与酵解基因的表达模式相似,进一步研究发现,干扰Myh3可以抑制C2C12细胞成肌状态下的糖酵解,不影响糖原合成。与成肌状态不同,在C2C12细胞成脂状态下干扰Myh3,抑制了糖原合成和糖酵解。     

Rheb过表达在前体脂肪细胞株3T3-L1分化中的作用

目的:利用前体脂肪细胞株3T3-L1细胞观察mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路中上游调控因子Rheb(Ras homolog enriched in brain)对其分化的影响。方法:利用高表达Rheb的基因重组质粒转染前体脂肪细胞株,3T3-L1。通过蛋白质免疫印迹实验鉴定质粒成功转染细胞后,诱导该细胞脂肪分化。予以分化第8天的3T3-L1细胞油红染色,并检测细胞内甘油三酯的含量。另外,我们用Western blot方法检测脂肪细胞特异性转录因子PPAR-γ(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ)和C/EBP-α(CCAAT-enhancer-binding protein-α)的表达情况来研究Rheb在脂肪细胞分化过程中的作用。结果:我们成功构建了高表达Rheb的3T3-L1细胞株,发现高表达Rheb后可以促进脂滴的生成,油红O染色有显著区别,与对照组相比Rheb高表达组的三酰甘油含量明显升高(P0.05);C/EBP-α和PPAR-γ等脂肪细胞特异性的转录因子蛋白表达量与对照组相比也均有升高(P0.05)。结论:Rheb基因作为mTOR通路上游调控因子,可以促进脂肪细胞的分化。     

绿原酸在小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化进程中的作用

目的：探讨绿原酸（CGA）对小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。方法：培养小鼠3T3-L1前脂肪细胞,分别设置空白对照组（CG）、阳性对照组罗格列酮组（RG）、阴性对照组GW9662组 （GG）和绿原酸组（CGA）。油红O染色观察小鼠3T3-L1前脂肪细胞分化后的细胞形态变化以及脂滴形成情况;组织细胞甘油三酯（TAG）酶法测定各组分化后的细胞TAG积累量;实时荧光定量PCR技术（qPCR）检测小鼠3T3-L1前脂肪细胞在分化过程中关键基因PPARγ2 mRNA表达水平。结果：CGA组被油红O染色的区域大于CG组和GG组,但CGA组颜色没有RG组鲜艳,且脂滴形状也与RG组存在差异。CGA组TAG积累量低于CG组和RG组,与CG组比较无显著性差异（P>0.05）,但与RG组比较有显著性差异（P<0.05）。在分化过程中,CGA组和RG组PPARγ2 mRNA的表达量高于CG组和GG组,有显著性差异（P<0.01）,GG组PPARγ2 mRNA的表达量自细胞分化第4d起低于CG组,有显著性差异（P<0.01）。结论：CGA可以促进小鼠3T3-L1前脂肪细胞的分化,同时降低分化后成熟脂肪细胞中TAG的积累量,其机制与分化相关因子PPARγ2的表达有关。     

MiR-186-5p对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响研究

目的:探究miR-186-5p对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖、分化的影响及其潜在的分子机制。方法:qRT-PCR检测miR-186-5p在不同周龄小鼠白色脂肪组织及3T3-L1前脂肪细胞增殖分化过程中的表达变化;通过脂质体将miR-186-5p mimics、inhibitors转染入增殖液或分化液培养的3T3-L1细胞后,利用CCK-8、EdU和qRT-PCR检测3T3-L1前脂肪细胞增殖变化,油红O染色观察其脂滴形态;通过生物信息软件TargetScan和双荧光报告系统分别对miR-186-5p靶基因进行预测和确认。结果:(1) miR-186-5p在1～6周龄小鼠的白色脂肪组织及3T3-L1前脂肪细胞自然分化过程中表达量均逐渐上调。(2)与阴性对照相比,mimics或inhibitors转染分别显著地促进或抑制了miR-186-5p的表达。(3)过表达miR-186-5p后,3T3-L1前脂肪细胞的增殖速率减慢,脂滴增大增多;而抑制miR-186-5p后,3T3-L1前脂肪细胞增殖速率增快,脂滴数量减少,且粒径变小。其中过表达miR-186-5p显著地降低了野生型Wnt5a和Mapk1 3'-UTR活性,而突变相应的绑定位点可解除该抑制作用。结论:miR-186-5p可抑制3T3-L1前脂肪细胞增殖,且通过直接靶向Wnt5a和Mapk1以促进其分化为成熟脂肪细胞。     

槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响

目的：观察槟榔碱对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响并探讨其可能机制。方法：采用经典的"鸡尾酒"法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化成熟,随后用不同浓度的槟榔碱（0、25、50、100 μmol/L）处理成熟脂肪细胞72 h。72 h后,四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞的活性;油红O染色观察胞浆内脂滴情况;Western blot检测脂肪酸合成酶（FAS）、甘油三酯脂肪酶（ATGL）、激素敏感性脂肪酶（HSL）蛋白表达。结果：诱导分化成熟的脂肪细胞胞浆内可见大量脂滴;MTT显示：0~100 μmol/L槟榔碱对脂肪细胞活力无显著影响;油红O染色后脂质含量测定结果表明槟榔碱能减少成熟脂肪细胞中脂质含量;Western blot结果显示：与0 μmol/L组（对照组）相比,槟榔碱可显著降低脂肪细胞内FAS的蛋白表达,增加ATGL和HSL的蛋白表达;其中以50 μmol/L组最为显著。结论：槟榔碱使脂肪细胞脂解增强,可能与降低脂质合成关键酶FAS的表达,增加脂质分解代谢关键酶ATGL和HSL的表达有关。     

LMO4 modulates proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

Previous microarray analyses revealed that LMO4 is expressed in 3T3-L1 preadipocytes, however, its roles in adipogenesis are unknown. In the present study, using RT-PCR sequencing and quantitative real-time RT-PCR, we confirmed that LMO4 gene is expressed in 3T3-L1 preadipocytes and its expression peaks at the early stage of 3T3-L1 preadipocyte differentiation. Further analyses showed that LMO4 knockdown decreased the proliferation of 3T3-L1 preadipocytes, and attenuated the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes, as evidenced by reduced lipid accumulation and down-regulation of PPARγ gene expression. Collectively, our findings indicate that LMO4 is a novel modulator of adipogenesis.     

Fucoxanthin exerts differing effects on 3T3-L1 cells according to differentiation stage and inhibits glucose uptake in mature adipocytes

Progression of 3T3-L1 preadipocyte differentiation is divided into early (days 0–2, D0–D2), intermediate (days 2–4, D2–D4), and late stages (day 4 onwards, D4-). In this study, we investigated the effects of fucoxanthin, isolated from the edible brown seaweed Petalonia binghamiae, on adipogenesis during the three differentiation stages of 3T3-L1 preadipocytes. When fucoxanthin was applied during the early stage of differentiation (D0–D2), it promoted 3T3-L1 adipocyte differentiation, as evidenced by increased triglyceride accumulation. At the molecular level, fucoxanthin increased protein expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα), sterol regulatory element-binding protein 1c (SREBP1c), and aP2, and adiponectin mRNA expression, in a dose-dependent manner. However, it reduced the expression of PPARγ, C/EBPα, and SREBP1c during the intermediate (D2–D4) and late stages (D4–D7) of differentiation. It also inhibited the uptake of glucose in mature 3T3-L1 adipocytes by reducing the phosphorylation of insulin receptor substrate 1 (IRS-1). These results suggest that fucoxanthin exerts differing effects on 3T3-L1 cells of different differentiation stages and inhibits glucose uptake in mature adipocytes.     

Antiadipogenic effect of carnosic acid,a natural compound present in Rosmarinus officinalis, is exerted through the C/EBPs and PPARγ pathways at the onset of the differentiation program

Background

Obesity is a serious health problem all over the world, and inhibition of adipogenesis constitutes one of the therapeutic strategies for its treatment. Carnosic acid (CA), the main bioactive compound of Rosmarinus officinalis extract, inhibits 3T3-L1 preadipocytes differentiation. However, very little is known about the molecular mechanism responsible for its antiadipogenic effect.

Methods

We evaluated the effect of CA on the differentiation of 3T3-L1 preadipocytes analyzing the process of mitotic clonal expansion, the level of adipogenic markers, and the subcellular distribution of C/EBPβ.

Results

CA treatment only during the first day of 3T3-L1 differentiation process was enough to inhibit adipogenesis. This inhibition was accompanied by a blockade of mitotic clonal expansion. CA did not interfere with C/EBPβ and C/EBPδ mRNA levels but blocked PPARγ, and FABP4 expression. C/EBPβ has different forms known as LIP and LAP. CA induced an increase in the level of LIP within 24 h of differentiation, leading to an increment in LIP/LAP ratio. Importantly, overexpression of LAP restored the capacity of 3T3-L1 preadipocytes to differentiate in the presence of CA. Finally, CA promoted subnuclear de-localization of C/EBPβ.

Conclusions

CA exerts its anti-adipogenic effect in a multifactorial manner by interfering mitotic clonal expansion, altering the ratio of the different C/EBPβ forms, inducing the loss of C/EBPβ proper subnuclear distribution, and blocking the expression of C/EBPα and PPARγ.

General significance

Understanding the molecular mechanism by which CA blocks adipogenesis is relevant because CA could be new a food additive beneficial for the prevention and/or treatment of obesity.