人工合成的黑曲霉NRRL3135菌株植酸酶基因在毕赤酵母系统中的高效表达

本文以黑曲霉(Aspergillus niger)NRRL3135菌株植酸酶基因为对象,通过基因人工合成的方法去除了该基因的内含子与信号肽编码序列,换用在毕赤酵母(Pichia pastoris)中使用频率较高的密码子以优化其表达。该人工合成植酸酶基因(PhyA-as)以N端融合的方式正确插入到毕赤酵母表达载体pPICZαA。通过电击将重组表达载体整合入酵母染色体DNA中得到重组转化子。SDSPAGE结果与表达产物酶学性质研究表明植酸酶得到分泌表达,且与天然产物性质基本一致。筛选得若干株高产基因工程菌,其中SPANⅢ菌株达到了在摇床培养条件下,每毫升发酵液产生165000u植酸酶的水平,基本满足工业化生产的要求。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赫酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25（A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1．4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体（命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母,经G418抗性筛选,酶活性测定,Southern 印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP－NP－1（23869．4u/ml),PP-NP-2(20533.0u/ml),PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活（513.4u/ml)的46．46倍,39．99倍和69．46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

黑曲霉N25植酸酶phyA基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达的研究*

从黑曲霉N25(A.niger China strain)中提取出染色体DNA,根据已经测定出的植酸酶phyA基因全序列设计了一对引物,采用高保真度的聚合酶Advangage-HF扩增到了去除信号肽和内含子后约1.4kb片段,对该片段进行了克隆及序列测定。将该序列与植酸酶phyA基因全序列进行了比较。以此片段构建成功了pPIC9K-phyA载体(命名为pPNP-1),并转化毕赤巴斯德酵母。经G418抗性筛选、酶活性测定、Southern印迹和Western印迹,获得了高效表达的转化子PP-NP-1(23869.4u/ml)、PP-NP-2(20533.0u/ml)、PP-NP-3(35646.7u/ml),其酶活性分别是出发菌株的酶活(513.4u/ml)的46.46倍、39.99倍和69.46倍,且转化子具有很好的遗传稳定性。     

黑曲霉Z6植酸酶基因phyA的克隆及表达

目的:克隆植酸酶基因phyA,构建毕赤酵母表达载体,转化毕赤酵母,并对重组工程菌的表达产物进行初步酶学性质研究.方法:以植酸酶高产菌株-黑曲霉Z6染色体DNA为模板,PCR扩增得到植酸酶基因phyA,序列鉴定后连接到毕赤酵母穿梭载体pPIC9K上,构建重组质粒pPIC9K-phyA,电击转化毕赤酵母KM71,筛选得到重组转化子.对重组工程菌表达产物进行SDS-PAGE分析和酶活性研究.结果:phyA序列分析表明该基因具有典型的植酸酶活性位点保守序列ArgHisGlyAlaArgTyrPro,与NC-BI已发表的植酸酶基因同源性较高,达到94%以上.该序列已提交GenBank,序列号为DQ318022.重组工程菌KM71-phyA7的PCR扩增证实了植酸酶基因已整合到酵母基因组中,植酸酶能有效分泌和表达,粗酶液酶活可达875U/mL.结论:植酸酶基因phyA在毕赤酵母中成功表达,为今后的定向改组奠定了基础.     

植酸酶基因中稀有密码子的改造提高其在毕赤酵母中的表达量

对来源于黑曲霉N2 5(AspergillusnigerChinaStrain)的植酸酶基因phyA进行PCR介导的定点突变 ,不改变其所编码氨基酸 ,选用毕赤酵母偏爱的密码子对该基因保守序列中第 81位和第 85位的Arg密码子进行同义突变 .构建了含正确突变的克隆载体pUC18 phyAm 和酵母表达载体pPIC9k phyAm,电击转化毕赤酵母 ,经MM、MD平板筛选和产物的酶活性测定 ,筛选出突变与未突变高酶活酵母转化子各 2株 .这 4株转化子的Southern印迹结果表明 ,phyA基因以单交换方式单拷贝整合到酵母染色体DNA中 .表达产物的SDS PAGE分析表明 ,重组酵母中的植酸酶能有效分泌和表达 ,蛋白质分子大小为 70 15kD .转化子酶活测定结果表明 ,经密码子优化的突变重组酵母酶活力明显高于未进行优化的重组酵母转化子 .经密码子优化的突变重组酵母株PP NPm 8于麦芽汁培养基中诱导 36h后酶活力可达 4 76 0 0U/ml,其活力比未优化重组酵母株PP NP 2 (2 36 6 7U/ml)提高了约 1倍 ,且重组转化子遗传稳定性良好 .     

来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因在毕赤酵母中的高效表达

柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)来源的植酸酶是目前报道的比活最高的植酸酶。按照毕赤酵母(Pichiapastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于柠檬酸杆菌的高比活植酸酶基因AppA进行了密码子优化改造。改造后的基因AppA(m)按正确的阅读框架融合到毕赤酵母表达载体pPIC9的α-因子信号肽编码序列3′端,通过电击转化得到重组转化子。通过PCR验证,AppA(m)已整合在酵母染色体上。SDS-PAGE分析和表达产物的研究表明,植酸酶得到了高效分泌表达,在5L发酵罐中植酸酶蛋白表达量达到3·2mg/mL发酵液,发酵效价达到每毫升发酵液1·4×107IU以上,高于目前报道的各种植酸酶基因工程菌株的发酵效价。     

黑曲霉N14植酸酶基因在巴斯德毕赤酵母中的高效表达

从黑曲霉N14基因组DNA中扩增出植酸酶phyA基因表达片段 ,并将其克隆到pMD18-T载体中。以此片段构建了pPIC9K-phyA重组表达载体 ,目的片段以正确的阅读框架插入到pPIC9K的多克隆位点EcoRⅠ和NotⅠ之间。重组表达载体经XbaⅠ线性化处理 ,电击转化毕赤酵母 ,经G418抗性筛选、酶活性测定、PCR鉴定和SDS-PAGE分析 ,获得了两株产酶活性分别为 14 39583u mL发酵液 (PP N1422 )和14 89083u/mL发酵液 (PP-N1444)的高产工程菌 ,其酶活性分别是出发菌株酶活性 (422u/mL)的 34113倍和 35286倍 ,重组酵母具有很好的遗传稳定性。重组植酸酶在pH值 2.5～3.0和 5.0～5.5时酶活性最高 ,且在pH4.5～6.5之间均有相当高的酶活性 ,最适作用温度为55℃。     

植酸酶基因的多点突变及在毕赤酵母中的高效表达

根据毕赤酵母基因的密码子选择偏爱性,不改变其编码氨基酸序列,对来源于黑曲霉N25植酸酶phyA基因,进行了突变,构建了含有正确突变的酵母表达载体pPIC9k-phyAm-4,电击转化毕赤酵母,获得优化了密码子的重组酵母转化子。经PCR鉴定表明,植酸酶基因已整合到酵母基因组中; 表达产物的SDS-PAGE分析表明,酶蛋白分子大小为70.15KD。Southern blotting结果表明,phyA基因整合到酵母染色体DNA中;转化子酶活测定结果表明,经密码子优化的重组酵母PP-NPm-4-2酶活可达136900U/ml,比Arg没有优化的PP-NPm-8 (47600 Uoml-1)酶活高约2.8倍。     

黑曲霉WY-6植酸酶的表达、纯化及性质研究

目的:表达黑曲霉WY-6植酸酶基因及研究重组酶的性质。方法:通过PCR方法从黑曲霉WY-6基因组中扩增出植酸酶基因,并将该基因表达在毕赤酵母中,再利用蛋白质分离纯化技术对重组酶进行纯化,并测定其性质。结果:黑曲霉WY-6植酸酶基因成功表达在毕赤酵母中,重组植酸酶经饱和硫酸铵分级沉淀、超滤和阴离子交换层析步骤后得以纯化,纯化后的植酸酶比活力为147U/mg,分子量为67kDa,两个最适pH分别为3.0和5.5,最适温度为55℃,与胃蛋白酶以0.01的比率(胃蛋白酶/植酸酶,wt/wt)混合作用2h后仍保留70.9%残余活力。结论:获得了具有商业应用潜能的基因工程植酸酶。     

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化与生物功能研究

内皮抑素（Endostatin）是近年来新发现的一种内源性新生血管生成（Angiogenesis）抑制因子,通过抑制新血管生成而抑制肿瘤的形成和转移且不会引起耐药性,具有极高的临床应用前景。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris)具有表达率高、产物可分泌、可对高等真核生物蛋白正确进行翻译后加工、遗传稳定、发酵工艺成熟等优点被用来进行重组人Endostatin的表达。本研究用PCR的方法从人胎肝cDNA文库中扩增出人Endostatin的cDNA,测序正确后转入毕赤巴斯德甲醇酵母,并获得了高效可溶型表达,用肝素亲和层析的方法进行纯化,纯化后产物经SDSPAGE薄层扫描分析纯度达987％以上,质谱测定分子量为2043kD与理论值一致,蛋白质N端序列测定结果为SPPAHTHRDFQPVLH与天然序列一致。生物活性检测证明可抑制鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）的新生血管生成（Angiogenesis),并可抑制血管内皮细胞的增殖。因此用酵母表达系统可以得到具有生物活性的内皮抑素,经纯化后可用于进一步的生物功能和作用机理试验。     

黑曲霉葡萄糖氧化酶基因的克隆及其在酵母中的高效表达

将黑曲霉葡萄糖氧化酶(GOD)基因重组进大肠杆菌酵母穿梭质粒Ppic9,转化甲基营养酵母Pichia pastoris GS115,构建出GOD的高产酵母工程菌株。在酵母αFactor及AOX1基因启动子和终止信号的调控下,黑曲霉GOD在甲基酵母中大量表达并分泌至胞外,经甲醇诱导3～4d,发酵液中的GOD活力可达30～40u/mL。SDS-PAGE证实GOD在培养物上清中的含量显著高于其它杂蛋白,约占胞外蛋白总量的60%～70%,经Q SepharoseTMFast Flow离子交换柱一步纯化即达电泳纯。重组酵母GOD比活达426.63u/mg蛋白,是商品黑曲霉GOD的1.6倍。动力学性质分析表明,重组酵母GOD的K_m和K_cat分别为38.25mmol/L和3492.66s-1,与商品黑曲霉GOD相比,具有更高的催化效率。重组酵母GOD的高活力特性可有效提高葡萄糖传感器的线性检测范围。     

米曲霉植酸酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已发表的植酸酶基因phyA序列(GI：4815609和GI：22901877)设计引物,以米曲霉(Asperillus oryae Cohn,编号：ACCC30155)的总DNA为模板,利用PCR扩增得到目的片段。将此片段克隆到表达载体pPIC9K的EcoRI酶切位点构建重组质粒,通过电转化方式将重组质粒转化毕赤酵母(Pichia pastoris)。检测结果表明,植酸酶基因在毕赤酵母中得到了表达。     

血管生成抑制因子K4K5 Cdna基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

应用PCR方法,扩增人纤溶酶原cDNA基因中K4K5 cDNA片段,与酵母表达载体pPIC9K重组,获得表达质凿p9kkk-18。该质粒转化毕赤酵母菌GS115,用G418－YPD筛选高拷贝表型,PCR筛选K4K5 cDNA与酵母染色体整全形成的阳性克隆,阳性克隆用甲醇诱导表达。表达产物r-K4K5分子量约21.5kD,占分泌总蛋白80％以上,产物浓度为150－250mg/L。初步纯化产物抑制牛毛细血管内皮（BCE）细胞增殖与鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）新生血管生成。     

Screening, cloning and overexpression of Aspergillus niger phytase (phyA) in Pichia pastoris with favourable characteristics

AIMS: Using gene cloning and overexpression to obtain a potential industrial phytase as a feed additive to upgrade the nutritional quality of phytate-rich seed-based animal feed. METHODS AND RESULTS: A phyA gene from a high extracellular phytase-producing Aspergillus niger sp. was cloned and overexpressed in Pichia pastoris GS115 using the secretive expression vector pPICZalphaA. After cultivation for 4 days in buffered methanol complex medium (BMMY) containing methanol for induction, catalytically active phytase was secreted as a predominantly extracellular protein. The activity of the expressed phytase in fermented broth was 30 000-fold higher than that of native phytase with a specific activity of 503 U mg(-1). The Lineweaver-Burk plot indicated K(m) values of 0.196 mmol l(-1) for sodium phytate and 18.16 mmol l(-1) for p-nitrophenylphosphate (pNPP). Thermostability studies showed that recombinant phytase retained 70% activity after exposure to 90 degrees C for 5 min and 65% activity after 30 min, much higher than for commercial phytase. CONCLUSIONS: The higher activity and high thermostability of recombinant phytase enable it to withstand the temperatures of the feed pelleting process. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: The characteristics of this recombinant phytase, especially the good thermostability, are likely to render it of potential industrial importance.     

植酸酶phyAm基因结构延伸突变改善酶的热稳定性

将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因phyA^m重组于大肠杆菌表达载体pET-30b（＋）,以重组表达载体pET30b-FphyA^e为模板经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因phyA^m（在植酸酶基因C端增加了来源于pET-30b-FphyA^m载体上13氨基酸残基）。含突变基因的重组表达载体pPIC9k-phyA^e在GS115酵母中表达。纯化的突变酶pp-NP^e与野生型酶PP-NP^m-8相比：PP-NPA^e的最适反应温度上升了3气,75℃处理10min,热稳定性提高21％,比活力略有提高。最适反应pH为5．6,有效pH范围pH4,6到pH6．6。比未突变酶扩大了0.4单位。     

黑曲霉葡萄糖淀粉酶Ⅰ基因的克隆及在酵母中的表达

采用RT—PCR技术,从黑曲霉的菌丝体RNA中扩增出葡萄糖淀粉酶GAI的结构基因,将其连接到pPIC9载体中,转入巴斯德毕赤酵母GSll5中,获得12株Mut＇重组酵母;甲醇诱导目的蛋白分泌表达,葡萄糖淀粉酶酶活最高达180U／ml,占上清液蛋白的38％。通过GAI在巴斯德毕赤酵母中的表达,重点讨论了目的基因拷贝数,基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。