问号钩端螺旋体中一个新的OmpA家族蛋白抗原性及保守性研究

目的克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans)黄疸出血群赖型赖株中一个新的外膜蛋白(Omp)A家族基因LA0301,研究LA0301编码蛋白的抗原性和在15个钩端螺旋体(简称钩体)血清群代表株中的保守性,探讨其在疫苗研究中的意义。方法生物信息学软件分析预测LA0301的特征。构建原核表达重组体pQE31-LA0301,经IPTG诱导后用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白质印迹法(Western blot)鉴定表达情况。用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western印迹检测其免疫反应性和在不同血清型钩体中的保守性。酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western印迹检测兔抗钩体全菌血清中的LA0301编码蛋白的抗体。结果生物信息学预测结果显示,LA0301具有OmpA家族的结构域。克隆表达了重组质粒pQE31-LA0301,重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生特异性抗体,效价为1:32000。在兔抗钩体全菌血清中检测到特异的LA0301蛋白抗体,并在15个血清群的代表株钩体中均可检测到LA0301蛋白。结论LA0301蛋白是问号钩体中一个新的OmpA家族蛋白,具有良好的抗原性和保守性,并且能在钩体感染的过程中刺激机体产生相应的抗体。为进一步研究钩体新型疫苗候选基因奠定了基础。     

致病钩体表层膜蛋白新基因（Lslp）的克隆表达及免疫原性研究

克隆表达钩端螺旋体表层膜蛋白新基因Lslp并分析表达产物的免疫原性。根据前期研究得到的致病钩体新基因Lslp(GenBankAF32 5 80 7)的序列设计引物 ,在 6株致病钩体中扩增Lslp基因并测序。以BamHⅠ酶切Lslp和pGEX 1 λT ,构建重组质粒并用酶切和PCR鉴定 ,进一步在大肠杆菌中诱导表达 ,并进行免疫印迹分析 ;纯化表达产物免疫家兔 ,ELISA检测血清抗体滴度。结果显示Lslp在 6株致病钩体中均能扩增出相应片段 ,且序列同源性达到99 6 % ;构建高效原核表达重组质粒pGST LslP ,经IPTG诱导在大肠杆菌中可表达出 6 6kDGST融合蛋白 ,并能与全钩抗血清发生免疫印迹反应 ;将上述融合蛋白免疫新西兰大白兔产生 1 :5 1 2 0高滴度的IgG抗体。研究结果提示致病钩体膜蛋白新基因Lslp可在大肠杆菌进行高效表达 ,表达产物能被全钩抗血清识别 ,为研究钩体的致病机制和筛选保护性抗原提供了基础     

猪丹毒丝菌C43311株spaA基因N端免疫保护区的克隆和表达

采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序.用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-SpaA-N,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.测序结果表明spaA基因片段大小为1881bp,与已报道的不同血清型菌株spaA基因的核苷酸序列比较,核苷酸序列同源性在93%～99%之间.SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为64kDa,与预期的大小相近.Western印迹检测结果表明,表达的融合蛋白GST-SpaA-N能与C43311株SpaA蛋白的抗血清发生特异性反应,证明原核融合表达蛋白具有免疫反应性.     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a（＋）内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21（DE3）中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1：2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a（＋）-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0873的表达纯化及保守性分析

目的通过构建原核表达载体,获得纯化的肺炎链球菌S．pn重组假想蛋白SPD0873,并制备多克隆抗体,进一步分析其在常见S．pn菌株中的保守性。方法分离培养D39型肺炎链球菌,获取其基因组DNA。利用PCR方法扩增去除信号肽的spd0873序列,采用基因体外重组法将spd0873序列克隆到原核表达载体pET-32（a）内,测序鉴定。将重组质粒转化到E．coli Rossetta（DE3）中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的SPD0873重组蛋白,经Ni—NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白用SDS—PAGE和Western印迹鉴定;将鉴定后纯化的蛋白免疫BALB／C小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western印迹方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在5种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果克隆的spd0873序列与GenBank中的数据相符,并实现了SPD0873蛋白高水平的可溶表达。纯化蛋白免疫BALB／C小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western印迹验证SPD0873蛋白在5株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论成功制备了高滴度、高特异性的SPD0873蛋白多克隆抗体,同时,检测到SPD0873蛋白在5种常见的肺炎链球菌菌株中非常保守,为研究该蛋白的生物学功能及肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A N端保护区在大肠杆菌中的表达

目的:在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A(SpaA)N端保护区(SpaA-N),并检测其抗原性.方法:利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spoA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),再经IFrG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化.结果:扩增得到的spaA基因长1 881 bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64 000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应.结论:获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础.     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

HIV-1包膜蛋白gp41优势抗原的构建及可溶性表达

目的:筛选1型人免疫缺陷病毒(HIV-1)中国流行株中包膜蛋白gp41的优势抗原片段,构建具有区域流行代表性的HIV-1 gp41重组抗原,为改进现有HIV-1初筛试剂盒中使用的同类抗原奠定基础。方法:利用免疫斑点杂交和生物信息学方法,从收集自重庆、广州、上海的区域代表性150份HIV-1感染者血清标本中筛选gp41抗原性强的候选样本,利用RT-PCR及巢式PCR方法扩增包含重要抗原表位决定蔟的gp41基因片段,与原核表达载体pQE30连接,转化大肠杆菌M15构建gp41重组抗原表达菌株,表达后经亲和层析纯化、SDS-PAGE和Western印迹鉴定。结果:兔源HRP标记的gp41多抗能识别标本中gp41抗原性差异,得到候选样本,扩增包含gp41主要抗原表位片段;构建了包含gp41抗原表达簇的重组原核表达质粒,表达、纯化后经His标签抗体Western印迹鉴定为阳性。结论:高纯度的重组优势gp41抗原的构建和鉴定,为进一步改进现有HIV初筛诊断奠定了基础。     

波摩那型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因片段的克隆表达

目的　构建L3 2_pGEX_5x_2重组质粒 ,诱导表达重组钩端螺旋体外膜脂蛋白LipL3 2。方法　PCR获取编码LipL3 2的基因片段 ,构建重组克隆载体和表达载体 ,转化受体菌 ,诱导表达重组LipL3 2蛋白。将重组LipL3 2蛋白和钩体抗血清进行Western_blot。结果　扩增出约 750bp的LipL3 2成熟蛋白基因 ,LipL3 2基因插入pGEX_5x_2表达载体 ,表达产物谷胱甘肽S_转移酶 (GST ,2 6× 10 3)与LipL3 2蛋白的融合蛋白的相对分子质量约为 53× 10 3 ,与预期大小一致。Western_blot显示重组LipL3 2蛋白能与钩体抗血清特异结合。结论　LipL3 2蛋白能在大肠埃希菌中表达 ,重组LipL3 2蛋白具有免疫反应性     

重组丙型肝炎病毒核心蛋白的原核表达、纯化和抗体制备

本文旨在获得纯化丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白(HCV-C)及抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C与肝细胞相互作用的分子机制奠定基础。首先以HCV1b亚型HC-J4-91全基因组质粒为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增HCV-C基因,构建重组质粒pQE31-HCV-C。融合蛋白经原核表达、纯化后,免疫BALB/c小鼠,制备抗HCV-C多克隆抗体。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体效价,蛋白免疫印迹(Westernblot)和间接免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果显示,表达HCV-C的原核表达质粒pQE31-HCV-C构建正确,获得相对分子质量约22000的纯化融合蛋白。ELISA检测重组蛋白免疫小鼠的抗血清效价达1:12800。结果显示,自制的抗HCV-C多克隆抗体能特异性识别HCV-C。本研究获得了纯度较好、原核表达的HCV-C,并成功制备了抗HCV-C多克隆抗体,为深入研究HCV-C的致病机制提供了有实用价值的研究工具。     

Leptospire genomic diversity revealed by microarray-based comparative genomic hybridization

Comparative genomic hybridization was used to compare genetic diversity of five strains of Leptospira (Leptospira interrogans serovars Bratislava, Canicola, and Hebdomadis and Leptospira kirschneri serovars Cynopteri and Grippotyphosa). The array was designed based on two available sequenced Leptospira reference genomes, those of L. interrogans serovar Copenhageni and L. interrogans serovar Lai. A comparison of genetic contents showed that L. interrogans serovar Bratislava was closest to the reference genomes while L. kirschneri serovar Grippotyphosa had the least similarity to the reference genomes. Cluster analysis indicated that L. interrogans serovars Bratislava and Hebdomadis clustered together first, followed by L. interrogans serovar Canicola, before the two L. kirschneri strains. Confirmed/potential virulence factors identified in previous research were also detected in the tested strains.     

AN INDIRECT ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY FOR THE DETECTION OF LEPTOSPIRA INTERROGANS SEROVAR POMONA ANTIBODIES IN BOVINE SERA

An indirect ELISA was developed and initially evaluated for the detection of bovine antibodies to Leptospira interrogans serovar pomona. The antigen used in this ELISA was extracted from a serovar pomona culture supernatant by a combination of centrifugation, digestion with proteinase K and ultra-centrifugation. The antigen showed little cross-reaction with immune rabbit sera to L. interrogans serovars copenhageni, grippotyphosa, hardjo and sejroe and, Leptospira biflexa serovar patoc. Some cross-reaction was observed with immune rabbit serum to L. interrogans serovar canicola. The relative sensitivity of the ELISA was 94.76% confidence interval =± 3.32%) when estimated with bovine sera (n=172) with serovar pomona microscopic agglutination test (MAT) titers of 100. The relative specificity of the ELISA was 99.28% (95% confidence interval = 1.40%) when estimated with bovine sera (n=139) with MAT titers of <100 to L. interrogans serovars canicola, copenhageni, grippotyphosa, hardjo, pomona and sejroe. Thirty six of 258 field sera (13.95%) with serovar pomona MAT titers of <100, gave positive reactions in the ELISA.     

创伤弧菌vvhA基因的克隆、原核表达系统的构建及鉴定

目的 克隆创伤弧菌（Vibrio vulnificus,Vv）溶细胞素基因（υυhA）,构建原核表达系统并鉴定其表达产物的免疫性.方法 采用PCR技术从Vv GTC333和WZ01株DNA中扩增全长υυhA基因,T-A克隆后测定其核苷酸序列.采用pET32a质粒构建vvhA基因原核表达载体,在E coli BL21（DE3）宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导目的重组蛋白rVvhA表达,采用Ni-NTA亲和层析法提纯rVvhA,SDS-PAGE检测表达和提纯效果.采用兔抗Vv全菌抗体的Western Blot和兔抗rVvhA血清的免疫扩散试验鉴定其免疫反应性和免疫原性.结果 所克隆的vvhA基因核苷酸序列与GeneBank公布的同源性分别为96.09%和98.26%.在0.5 mmol/L IPTG诱导下,rVvhA产量可占细菌总蛋白的18%.提纯的rVvhA经SDS-PAGE后仅显示单一的蛋白条带.重组蛋白rVvhA能与兔抗Vv全菌抗体发生特异性结合,免疫家兔可获得高效价抗体.结论 该研究成功地构建了创伤弧菌υυhA基因高效原核表达系统,所表达的rVvhA具有良好的免疫原性和免疫反应性,可作为Vv免疫检测试剂盒及疫苗的抗原.     

Helix handedness of Leptospira interrogans as determined by scanning electron microscopy.

Representative serovars and strains of the seven genetic groups of Leptospira interrogans, and two previously studied serovars, were all found to form exclusively right-handed helices as determined by scanning electron microscopy. No change in handedness occurred in cells grown in a minimal medium (Tween-80 albumin) compared to cells grown in a rich medium (rabbit serum). The right-handedness of the organisms was related to the evolution, cell wall structure, and the mechanism of motility of L. interrogans.     

不同毒力钩端螺旋体引起THP-1细胞中细胞因子表达的研究

本文旨在通过观察不同毒力钩端螺旋体激活人单核巨噬细胞株THP-1中细胞因子信号途径的差异,探讨天然免疫在钩端螺旋体病发病机制中的作用.将3种不同毒力的钩端螺旋体--赖型有毒株Lai株、赖型减毒株IPAV株及非致病性Patoc型Patoc 1株与诱导后的细胞相互作用,在作用0、2、12、24、48 h 后收集标本,应用实...     

腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究

根据GenBank公布的腐败梭菌α毒素基因序列,设计了一对引物,并以腐败梭菌基因组为模板,经PCR特异性扩增出腐败梭菌菌株HeB01的α毒素基因。序列分析表明,该基因产物大小为1323bp,与GenBank报道的4个腐败梭菌参考菌株α毒素基因序列同源性高于99·5%。将扩增的α毒素基因定向克隆到原核表达载体pQE30中,得到重组质粒pQE30-α,将重组质粒转化大肠杆菌M15中,得到重组菌株M15(pQE30-α),经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析可见表达的48kD特异条带;Westernblot和ELISA检测实验表明:表达的α毒素与抗天然α毒素抗体发生特异性反应,说明α毒素蛋白具有较好的免疫原性。将表达的α毒素蛋白制成类毒素疫苗,免疫小鼠后,具有一定的保护能力,表明该重组菌株有望作为腐败梭菌基因工程类毒素疫苗的候选生产菌株。     

Antibodies against Leptospira interrogans in California sea lion pups from Gulf of California

One hundred and twenty-five serum samples from California sea lion (Zalophus californianus californianus) pups, and one from an adult female from eight reproductive rookeries located in seven islands in the Gulf of California (Mexico), were collected during the 1994-96 reproductive seasons. These were tested for antibodies to 19 serovars of Leptospira interrogans using a Microscopic Agglutination Test (MAT). Forty-one samples (32%) had antibody levels from 1:20 to 1:320 to one or more serovars. The most frequently detected serotypes were Leptospira interrogans hardjo (n = 13), cynopteri (8), ballum (6), and szwajizak (5). Serovars with the highest prevalence were Leptospira interrogans hardjo and serjoe (1:320), ballum (1:160), and cynopteri, girppotyphosa, and tarassovi (1:80). Based on these results, exposure of sea lions to L. interrogans serovar hardjo seems to be relatively common among colonies located in the islands of the Gulf of California in contrast with those located on the Pacific coast, where the most frequently detected serovar is L. interrogans serovar pomona.     

共表达HIV-1中国流行株gp120与IL-18重组鸡痘病毒的构建及其免疫原性观察

为筛选我国的HIV-1疫苗候选株,以鸡痘病毒282E4中国疫苗株为载体,构建了共表达中国流行株HIV-1外膜蛋白gp120和IL-18的重组鸡痘病毒,并将该重组鸡痘病毒免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠脾特异性CTL杀伤活性和血清抗体水平。结果显示,HIV_1外膜蛋白gp120和IL-18不但可在重组鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞中表达,而且可在重组鸡痘病毒感染的哺乳动物细胞中表达。重组病毒具有良好的免疫原性,可诱导小鼠产生特异性抗体和脾特异性CTL反应,且IL_18发挥了免疫佐剂的作用。本研究结果为制备安全、有效的HIV-1基因工程活载体疫苗奠定了基础。