RNA的重组技术

RNA的重组技术是一种制造大量RNA的新技术。这是应用噬菌体Qβ的RNA复制酶,在含有少量RNA模板的体系中产生大量的RNA产物的新方法,在其中应用了RNA重组体以维持QβRNA复制酶的严格特异性。     

Qβ复制酶与RNA重组技术

以往的遗传工程主要是设计生物的基因蓝图,转移DNA的过程,其关键是DNA的重组操作。自1983年哥伦比亚大学的Kramer,Mills和Miele建立RNA重组技术以后,人们认为遗传工程的内容必将极大地丰富起来。一、Qβ复制酶和MPV-1 RNA RNA 重组技术是在需求大量 RNA 的刺激下发展起来的。细胞内的RNA是DNA的转录产物,而转录要求一定的条件,进行的规模也很有限。即使在转录活跃的情况下,一个DNA分子一次产生一个RNA分子,RNA分子的量只能按算术级数增长。因此要想得到足     

Qβ复制酶与RNA重组技术

以往的遗传工程主要是设计生物的基因蓝图,转移DNA的过程,其关键是DNA的重组操作.自1983年哥伦比亚大学的Kramer,Mills和Miele建立RNA重组技术以后,人们认为遗传工程的内容必将极大地丰富起来. 一、Qβ复制酶和MPV-1 RNA RNA重组技术是在需求大量RNA的刺激下发展起来的.细胞内的RNA是DNA的转录产物,而转录要求一定的条件,进行的规模也很有限。即使在转录活跃的情况下,一个DNA分子一次产生一个RNA分子,RNA分子的量只能按算术级数增长.因此要想得到足     

可使RNA体外特异性扩增的Qβ复制酶技术

Q_β复制酶是由 Q_β噬菌体感染大肠杆菌后诱导产生的一种 RNA 依赖性的 RNA 聚合酶,对 MDV-1RNA 的复制有高度特异性和极高的扩增效率。可利用 RNA 重组技术,以 MDV-1RNA 为载体,制备含特异 RNA探针的可复制的重组 MDV-1RNA,用 Q_β复制酶体外特异性扩增与靶分子杂交的RNA 探针,以达到检测靶分子的目的。这项技术比 PCR 技术更先进,更优越,具有广泛的应用前景。一、Q_β复制酶Q_β复制酶(Q-beta replicase)是由Q_β噬菌体感染大肠杆菌后诱导产生的一种RNA 依赖性的 RNA 聚合酶,由四个亚     

Qβ噬菌体RNA复制酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

构建了带有Qβ噬菌体RNA复制酶cDNA基因的重组表达质粒pKK-Rep,采用电泳分析的方法考察了不同浓度的IPTG、不同的葡萄糖浓度对pKK-Rep在E.coli JM109中表达RNA复制酶蛋白的影响。结果表明,0.01mmol/L IPTG可以有效诱导pKK-Rep表达RNA复制酶蛋白,但表达的RNA复制酶蛋白大多数为不溶性蛋白。在培养基中添加0.02%的葡萄糖对该RNA复制酶蛋白的组成型表达无明显的影响,但当葡萄糖浓度增加至0.04%-1.0%时,这种组成型表达量显著降低。采用MDV－poly( )RNA作为模板来体外检测可溶性表达蛋白的活性,结果表明其具有体外特异扩增RNA模板的活性。     

Qβ RNA 复制酶中亚基的共表达对β亚基溶解性的影响

在体外RNA和蛋白质合成及自复制系统的研究中 ,QβRNA复制酶作为以RNA为模板的RNA聚合酶 ,是比较重要的应用酶种之一。该酶由 4个亚基组成 ,其中只有 β亚基是由病毒基因编码 ,而其他 3个亚基都是宿主蛋白。利用普通表达载体合成Qβ复制酶时 ,得到的 β亚基几乎都是不溶性蛋白 ,从而影响了Qβ复制酶的活性和产率。为尝试提高 β亚基的溶解性 ,构建含有β亚基基因的表达质粒pBAD 33 rep ,同时利用pET2 1a( )为表达载体表达其他 3个亚基进行共表达研究。不同亚基组合的共表达结果通过SDS PAGE分析表明 ,当 β亚基与EF Tu Ts亚基共表达时 ,溶解度有一定的提高 ,而且可溶性部分也具有复制酶活性。通过调节共表达诱导物浓度 ,相对增强可溶性 β亚基的表达 ,可溶性Qβ复制酶酶量得到相应的提高     

RNA的生物合成与加工(一)

所有细胞的RNA都是按照DNA模板的指令,由RNA聚合酶催化合成的。RNA的生物合成(转录)过程的有些地方与DNA复制相似,如底物是核苷三磷酸,合成方向是5′→3′。但,RNA聚合酶不需要引物,也不具备有校正作用的核酸外切酶活力。DNA模板在RNA合成中是全保留的,而在DNA复制中则是半保留的。原核生物的转录原核生物转录的源料主要是从大肠杆菌取得的。大肠杆菌的所有RNA都是由同一种RNA聚合酶催化合成的。这种酶的分子量为460KDa,全酶的亚基组成为α_2ββ′σ,核心酶为α_2ββ′。σ亚基只在转录的启动中起作用,     

R环的形成及对基因组稳定性的影响

R-环是由一个RNA:DNA杂交体和一条单链状态的DNA分子共同组成的三链核酸结构。其中, RNA:DNA杂交体的形成起因于基因转录所合成的RNA分子不能与模板分开, 或RNA分子重新与一段双链DNA分子中的一条链杂交。在基因转录过程中, 当转录泡遇到富含G碱基的非模板链区或位于某些与人类疾病有关的三核苷酸卫星DNA时, 转录泡后方累积的负超螺旋可促进R环形成。同时, 新生RNA分子未被及时加工、成熟或未被快速转运到细胞质等因素也会催生R环。研究表明, 细胞拥有多种管理R环的方法, 可以有效地管理R环的形成和处理已经形成的R环, 以尽量避免R环对DNA复制、基因突变和同源重组产生不利影响。文章重点分析了R-环的形成机制及R环对DNA复制、基因突变和同源重组的影响, 并针对R-环诱导的DNA复制在某些三核苷酸重复扩增有关的神经肌肉退行性疾病发生过程中的作用进行了分析和讨论。     

DNA重组技术在水稻育种上的应用

七十年代相继发现的限制性内切酶、质粒、转形变异现象等已发展成为分子生物学研究的基础。微生物领域开发的DNA重组技术(基因操作),在高等植物上的应用正方兴未艾。 DNA重组技术是指用能识别、切断特定碱基序列的限制酶,切出担当遗传信息的DNA,用DNA连接酶与在寄主内自动增殖具有双连结构的DNA质粒接合,形成重组DNA,再将重组DNA返回寄主细胞所进行的操作。转移进来的外源DNA与质粒DNA在寄主内同时增殖,来发现目的性状。在水稻等多种高等植物上,即使能鉴定、分离出目的基因,但运载其基因的有效媒介体,还大部分未被开发出来。     

Sanger链中止法的新进展——以M13为克隆的运载体进行DNA序列分析(续)

三.M13mpX复制形式(RF)的制备(图1-3) 虽然M13mpX是单链的噬菌体,一旦它感染到寄主细胞后,便成为双链超螺旋的复制形式(图3)。这样既便于限制性内切酶在其MCS处切开,也能通过连接酶的作用把待测DNA片段接进去,构成一个重组体。