兔多杀性巴氏杆菌C51-3株黏附蛋白的表达、纯化及其抗原性检测

应用PCR从兔多杀性巴氏杆菌C51-3株基因组DNA中扩增出编码36 kD黏附蛋白的cp36基因, 将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序。以重组质粒pMD18-cp36为模板, 用PCR扩增得到编码信号肽除外的成熟黏附蛋白基因cpm36, 并克隆到原核表达质粒pQE30中, 得到重组质粒pQE30-cpm36, 转化大肠杆菌M15, 在IPTG诱导下表达融合蛋白CPM36, 经Ni2+-NTA亲和层析纯化。DNA测序结果表明cp36基因片段大小为1032 bp, 与已报道的16个血清型多杀性巴氏杆菌cp36基因的核苷酸序列比较, 同源性在76.9%~100%之间。SDS-PAGE结果显示, 表达分子量约为37 kD的带有6×His标签的CPM36蛋白, 与预期分子量相符。Western blotting结果表明, 抗重组蛋白抗体分别能与CPM36蛋白和多杀性巴氏杆菌36 kD蛋白发生特异性反应, 证明原核表达蛋白具有抗原性, 为进一步开展多杀性巴氏杆菌免疫保护性抗原的研究奠定了基础。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-3株成熟黏附蛋白的表达及其免疫原性检测

目的：在大肠杆菌原核表达系统中高效表达禽多杀性巴氏杆菌成熟黏附蛋白Cpm39,并检测其免疫原性。方法：通过BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组载体pMD18-cpm39获得cpm39基因片段,将该基因片段克隆至表达载体pMAL-p2X上,构建表达质粒pMAL-p2X-cpm39,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,在IPTG诱导下表达融合蛋白,用禽多杀性巴氏杆菌C48-3株Cp39天然粘附蛋白的免疫血清经Western印迹检测其免疫原性。结果：SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白相对分子质量为78×103,与预期结果相符,而Western印迹结果表明诱导表达的融合蛋白MBP-Cpm39能与Cp39天然黏附蛋白抗体发生特异性反应。结论：构建了表达质粒pMAL-p2X-cpm39,获得了具有免疫原性的重组融合蛋白,为进一步研究禽多杀性巴氏杆菌成熟黏附蛋白的免疫保护功能奠定了基础。     

禽多杀性巴氏杆菌P1059成熟黏附蛋白的原核表达、纯化和抗原性检测

目的：建立rCPM36在大肠杆菌中的表达体系,纯化表达产物并检测其抗原性。方法：运用PCR方法从禽多杀性巴氏杆菌国际标准株P1059基因组中扩增出编码36kDa成熟黏附蛋白的cpm36基因,构建原核表达载体pQE30-cpm36,转化到大肠杆菌M15中并诱导表达目的蛋白,用镍离子螯合层析柱纯化目的蛋白及制备其抗体,Western印迹分析其抗原性。结果：SDS-PAGE结果显示目标蛋白以可溶性形式表达在大肠杆菌M15细胞质中,其相对分子质量为37kDa,Western印迹结果表明表达蛋白具有良好的抗原性。结论：成功构建出原核表达载体并实现了目的蛋白表达,用镍离子螯合层析柱纯化得到具有抗原性的蛋白,为进一步开展禽多杀性巴氏杆菌黏附因子和保护性抗原的研究奠定基础。     

副鸡禽杆菌aroA基因克隆及序列分析

旨在建立一种方便、高效的同源保守基因克隆方法,并对副鸡禽杆菌aroA基因进行克隆和结构分析。本试验以副鸡禽杆菌国际标准株145(C-3)基因组DNA为模板,用CODEHOP软件设计针对aroA基因的兼并引物,并运用改进的染色体步移方法扩增aroA基因序列;对该核酸序列及其编码蛋白进行结构分析并与该菌其他血清型及相关细菌进行序列比对分析。结果显示,获得了完整的aroA基因,全长1 293 bp。该基因编码由430个氨基酸组成的多肽,具有2个功能位点和5个抗原表位位点。不同血清型间氨基酸序列同源性为88.1%-100%,与其他相关细菌核酸同源性为75%以上。首次将兼并PCR和改进的染色体步移技术结合起来对副鸡禽杆菌aroA基因全长进行扩增研究,得到了预期的结果。     

呼吸道合胞病毒在北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲＴ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中,经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率为６５％,由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％,氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆及分子进化分析

根据已发表的鸡白介素18(IL-18)基因序列设计合成引物,以植物凝集素(PHA)和脂多糖(LPS)激活的AA肉鸡脾细胞mRNA为模板,通过RT-PCR扩增出编码鸡IL-18成熟蛋白的eDNA。将该eDNA克隆于pUCm-T载体,并对其进行测序,结果表明所克隆的核苷酸片段包含了全部成熟蛋白编码基因,成熟蛋白编码区507个核苷酸,编码169个氧基酸。把该基因编码的鸡成熟IL-18蛋白氨基酸序列与已公布的禽及哺乳动物IL-8成熟蛋白基因氧基酸序列进行比较,其同源性分别在96．5％～100％和20．1％～26．6％之间,分子系统进化树分析表明鸡IL-18与哺乳动物IL-18有共同的祖先,亲源关系较近,但在免疫系统选择性压力下,形成独特的种族特异性。鸡IL-18基因的克隆为体外表达鸡IL-18蛋白及作为免疫佐剂应用于预防接种的研究奠定了基础。     

呼吸道合胞病毒北京地区分离株G蛋白的基因分析

从经单克隆抗体证实为Ａ亚型的北京地区呼吸道合胞病毒（ＲＳＶ）分离株Ｂ７９中,用ＲＴ－ＰＣＲ扩增出编码Ｇ蛋白的基因片段,克隆至载体ｐＴＺ１８Ｒ中。经核苷酸序列测定证明,我国北京地区分离的Ａ亚型株Ｂ７９与ＲＳＶＡ亚型原型株（Ａ２株）Ｇ蛋白基因的核苷酸同源性为９３．８％,核苷酸的有义突变率达６５％。由核苷酸推导出氨基酸序列的同源性为８９．６％。氨基酸的变异主要集中在胞外区一个高度保守区的两端,而胞内区和跨膜区相对保守。本文探讨了我国北京地区ＲＳＶ分离株的Ｇ蛋白基因同原型株之间的变异,在疫苗研制中的意义。     

鹅Ⅰ型禽副粘病毒GPMV/QY97-1株HN基因的克隆和序列分析

在华南地区进行鹅病病因的调查过程中,从患病鹅群中分离到一株对鹅和鸡都有致病力的病毒,初步判定该病毒属于Ⅰ型禽副粘病毒,命名为GPMV／QY97—1株。以GPMV／QY97—1毒株的基因组RNA为模板,通过RT—PCR方法,扩增出血凝素-神经氨酸酶(HN)基因3’端和5’端的cDNA片段,分别将其克隆至pGEM—TEasy载体中,对其进行序列测定。序列分析表明,HN基因的cDNA全长为2024nt,编码571个氨基酸。序列中含有13个半胱氨酸残基和6个潜在的糖基化位点,其HN基因及编码蛋白结构与新城疫病毒株相符。将GPMV／QY97-1株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫病毒株的HN基因相应序列做比较后发现,它们的核苷酸序列同源性分别在89．6％～83．6％,氨基酸序列同源性在93．3％～87．9％。在同源性比较的基础上,进一步绘制了Ⅰ型禽副粘病毒株HN基因的系统发育树。这对于Ⅰ型禽副粘病毒毒力基因的功能分析和该病的分子流行病学调查有着重要意义。     

家蚕核型胸角体病毒酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

采用PCR方法克隆了家蚕核型多角体病毒中国镇江株（BmNPV-JZstrain）的酪氨酸蛋白磷酸酯酶基因（ptp),测定了该基因的核苷酸序列。比较了与相关病毒相应基因的同源性,并将该基因插入到原核表达质粒在大肠杆菌中进行了表达。该基因的编码部分由507个核苷酸组成,编码168个氨基酸残基的蛋白多肽,其中含有酪氨酸蛋白磷酸酶酯催化部位的“HC”基序。该基因与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV)ptp基因和BmNPV-T3株（日本）拟为ptp基因核苷酸序列的同源性分别为96．8％和98．2％,蛋白质氨基酸序列的同源性分别为97．0％和97．6％。将该基因插入到温度诱导型表达质粒pBV221的温控启动子PRPL之后,在大肠杆菌JM109中表达了具有催化活性的蛋白质,分子量约为19KD,表达产物能催化对硝基酚磷酸钠（PNPP）的脱磷酸反应,这种催化作用可被钒酸钠和ZnCl2抑制。     

慢性蜜蜂麻痹病毒Ch1株的编码区测序及其序列的分析

对中国分离株慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)Ch1编码区全基因序列进行克隆、测序、分析。利用RT-PCR方法和生物信息学软件,对本实验室分离到的Ch1株CBPV编码区的基因序列进行克隆,测序,与GenBank收录的CBPV毒株进行同源性比较,并以RdRp为靶基因构建了遗传进化树。结果显示,CBPV Ch1株的编码区由RNA1(GenBank No.KU950353)和RNA2(GenBank No.KU950354)两部分构成,全长5 979个核苷酸。其中RNA1片段全长3 674个核苷酸,编码3个开放阅读框,RNA2片段全长2 305个核苷酸,编码4个开放阅读框,RNA2片段中ORF2和ORF3,可能编码两个结构蛋白,分别命名为SP1和SP2。RNA1和RNA2核苷酸序列与2005年法国分离株Fr2核苷酸序列同源性最高,分别为96.1%和95.5%,但预测蛋白SP1核苷酸序列同源性与2006年乌拉圭分离株Ur1核苷酸序列同源性最高(96.9%)。基于RdRp为靶基因进行了遗传进化分析表明,Ch1株与Fr2株位于同一分支,且在该区域,Ch1株与Fr2株的核苷酸序列同源性最高(96.5%)。本实验成功分离到一株CBPV(KU950353,KU950354),并命名为Ch1株,完成了Ch1株CBPV的编码区的序列测定以及核苷酸序列与推导的氨基酸序列同源性比较及遗传进化分析,为研究CBPV的致病机制和免疫机制提供重要信息。     

Molecular analysis of the aroA gene of Pasteurella multocida and vaccine potential of a constructed aroA mutant

The aroA gene from Pasteurella multocida was cloned by complementation of the Escherichia coli aroA mutant AB2829 with a DNA library constructed in pUC18. The nucleotide sequence of the P. multocida aroA gene indicated an open reading frame encoding a protein of 441 amino acids, which showed a high degree of homology with the amino acid sequences of various other bacterial AroA proteins. The cloned P. multocida aroA gene was inactivated by insertion of a kanamycin-resistance gene and reintroduced by allelic exchange into the chromosome of P. multocida using the suicide vector pJM703.1. The P. multocida aroA mutant was highly attenuated in a mouse model. Mice immunized intraperitoneally with two doses of live P. multocida aroA mutant were completely protected against a lethal parental strain challenge.     

禽多杀性巴氏杆菌粘附蛋白Cp39的交叉免疫保护作用

【目的】比较体内外增殖禽多杀性巴氏杆菌荚膜蛋白、天然粘附蛋白Cp39和重组粘附蛋白rCp39对小鼠的交叉保护作用。【方法】用NaCl提取法制备鸡胚尿囊液和DSA培养基增殖的C48-3株荚膜蛋白,并用电洗脱方法纯化Cp39蛋白,将rCp39蛋白以可溶形式表达在大肠杆菌BL21后,用Amylose Resin亲和层析柱纯化。分别以100μg剂量的鸡胚尿囊液增殖菌体荚膜蛋白、DSA培养基培养菌体荚膜蛋白、纯化的Cp39蛋白和rCp39蛋白通过皮下注射各试验组小鼠,生理盐水为对照组,第二次免疫后2周分别以A:1型菌C48-3株(6.7×102cfu)和A:3型菌C51-3株(1.1×103cfu)进行攻毒试验。采集免疫后小鼠血清,用ELISA法检测抗体水平,并计算免疫保护率,来评价4种抗原对小鼠的交叉保护效果。【结果】SDS-PAGE结果显示,体内外增殖禽多杀性巴氏杆菌荚膜蛋白的条带和分子量相似,且体内外表达的Cp39蛋白的分子量相同;ELISA结果表明Cp39免疫组小鼠和rCp39免疫组小鼠血清rCp39蛋白特异性抗体的水平显著高于其他两组(P0.05);保护试验表明,体外增殖菌体荚膜蛋白免疫组小鼠对同源C48-3株和异源C51-3株攻毒的保护率分别为100%和60%,鸡胚尿囊液增殖菌体荚膜蛋白免疫组小鼠、Cp39免疫组小鼠和rCp39免疫组小鼠对同源C48-3株和异源C51-3株攻毒的保护率分别为100%和80%。【结论】粘附蛋白Cp39是禽多杀性巴氏杆菌荚膜蛋白中的主要交叉保护抗原,可以作为禽霍乱亚单位疫苗。     

猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原AN端保护区在大肠杆菌中的表达

目的：在大肠杆菌中表达猪丹毒丝菌C43065株表面保护性抗原A（SpaA）N端保护区（SpaA-N）,并检测其抗原性。方法：利用PCR方法从猪丹毒丝菌C43065株基因组中扩增出spaA基因片段,构建pMD18-spaA重组质粒并对插入片段进行测序;以pMD18-spaA重组质粒为模板,PCR扩增得到spaA-N基因片段,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,经序列测定证实正确后转化大肠杆菌BL21（DE3）,再经IPTG诱导表达GST-SpaA-N融合蛋白并纯化。结果：扩增得到的spaA基因长1881bp,编码由626个氨基酸残基构成的多肽;SDS-PAGE和Western印迹检测结果表明,诱导表达获得相对分子质量约64000的GST-SpaA-N融合蛋白,该融合蛋白能与相应抗体发生特异性反应。结论：获得了在大肠杆菌中可溶性表达的GST-SpaA-N融合蛋白,为进一步研究猪丹毒丝菌免疫保护性抗原奠定了基础。     

从人血液中克隆过氧化氢酶基因

目的从人血液中克隆过氧化氢酶基因。方法以新鲜的人血液为材料,提取全血RNA,运用RT—PCR方法扩增过氧化氢酶基因,构建pMDl8T／CAT克隆载体,并进行了不同来源过氧化氢酶的氨基酸序列同源分析。结果从人血液中成功扩增出过氧化氢酶基因,获得了重组载体PMD-18T／CAT,氨基酸序列分析的同源性达80％以上。结论从人血液中可以很方便地克隆出过氧化氢酶基因。     

猪丹毒丝菌C43311株spaA基因N端免疫保护区的克隆和表达

采用PCR从猪丹毒丝菌C43311株基因组中扩增出编码表面保护性抗原A的spaA基因片段,将其克隆到pMD18-T载体并对插入片段进行测序.用spaA基因N端免疫保护区(spaA-N)的特异引物从重组质粒pMD18-spaA中扩增得到spaA-N片段,将其定向插入原核表达载体pGEX-6p-2中,构建重组表达质粒pGEX-spaA-N,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达融合蛋白GST-SpaA-N,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物.测序结果表明spaA基因片段大小为1881bp,与已报道的不同血清型菌株spaA基因的核苷酸序列比较,核苷酸序列同源性在93%～99%之间.SDS-PAGE结果显示表达蛋白约为64kDa,与预期的大小相近.Western印迹检测结果表明,表达的融合蛋白GST-SpaA-N能与C43311株SpaA蛋白的抗血清发生特异性反应,证明原核融合表达蛋白具有免疫反应性.     

重组蛋白ES-Kringle5的表达、纯化及活性检测

目的：利用基因工程方法原核表达重组融合蛋白ES-Kringle5并进行纯化及活性检测。方法：ES-Kringle5是将内皮抑素N端的前27个氨基酸与Kringle5通过连接肽相连的重组融合蛋白,合成该重组蛋白的基因片段并插入载体pMD18-T中,然后克隆至大肠杆菌表达载体pET25b中并转化E.coli BL21（DE3）。乳糖诱导表达后经Ni-NTA亲和层析纯化后获得目的蛋白。通过抑制HUVEC细胞增殖实验检测其生物学活性。结果：重组质粒构建正确。利用乳糖诱导表达并降低诱导温度能增加目的蛋白的产量及可溶性表达。纯化后的重组蛋白纯度大于95%。生物学活性证明该重组蛋白具有抑制HUVEC的增殖能力。结论：具有生物学活性的重组蛋白ES-Kringle5可在大肠杆菌中高效表达,为研究其体内药效、药代及安全性评价奠定了基础。     

Cloning and sequencing of Serratia protease gene.

The gene encoding an extracellular metalloproteinase from Serratia sp. E-15 has been cloned, and its complete nucleotide sequence determined. The amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence reveals that the mature protein of the Serratia protease consists of 470 amino acids with a molecular weight of 50,632. The G+C content of the coding region for the mature protein is 58%; this high G+C content is due to a marked preference for G+C bases at the third position of the codons. The gene codes for a short pro-peptide preceding the mature protein. The Serratia protease gene was expressed in Escherichia coli and Serratia marcescens; the former produced the Serratia protease in the cells and the latter in the culture medium. Three zinc ligands and an active site of the Serratia protease were predicted by comparing the structure of the enzyme with those of thermolysin and Bacillus subtilis neutral protease.