FHL2通过相互作用抑制分化抑制蛋白家族成员的转录抑制活性

目的：探讨FHL2与Id（分化抑制蛋白）家族蛋白之间的相互作用及FHL2对Id蛋白功能的调控效应。方法：用GST-pulldown与免疫共沉淀（CoIP）方法检测FHL2与Id家族蛋白成员之间在体内外的相互作用;用共转染与报告基因驱动的萤光素酶方法检测FHL2对Id蛋白介导转录抑制效应的调控作用。结果：FHL2与Id家族的4个蛋白均存在直接的相互作用关系,表位分析结果显示FHL2蛋白中的第2个LIM结构域在FHL2/Id相互作用中是必需的,Id蛋白N端结构域在介导FHL2/Id相互作用中是必需的,FHL2/Id相互作用不依赖于Id蛋白中的螺旋-环-螺旋结构;通过相互作用,FHL2阻止了Id蛋白对碱性螺旋-环-螺旋转录因子E47转录活性的抑制作用。结论：FHL2是一个新识别的Id蛋白广谱的相互作用因子,通过对Id蛋白功能活性的抑制效应,FHL2可能参与Id介导的多种生物学效应以及肿瘤发生与进展。     

FHL2通过相互作用抑制Id2的功能活性

分化抑制蛋白2（Id2）通过抑制碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）类转录因子的功能活性调控多种组织细胞的分化发育,并参与人类多种肿瘤的发生与进展.Id2相互作用蛋白可能调控其翻译后的功能活性．本研究以HLH结构域缺失的Id2作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交方法对MCF-7 cDNA文库进行筛选,识别了1个新的Id2相互作用蛋白FHL2 (属于LIM蛋白家族的一员),哺乳动物双杂交实验系统验证了Id2与FHL2之间的相互作用,同时证实,该作用不依赖于Id2中的HLH结构域;GST-pulldown、免疫共沉淀方法,进一步证实FHL2/Id2之间的相互作用;免疫荧光共定位实验结果证实,FHL2/Id2相互作用主要发生在细胞核内;共转染实验结果发现,FHL2通过相互作用阻抑了Id2对bHLH类转录因子E47的功能抑制活性．总之,本研究识别了1个新的Id2相互作用蛋白FHL2,通过直接的相互作用,FHL2抑制了Id2的功能活性,FHL2可能参与调控Id2介导的细胞分化与发育过程,并可能参与肿瘤的发生与进展．     

FHL2转录激活结构域的定位

LIM蛋白家族成员FHL2 (fourandhalfLIMdomainprotein)在转录调节、细胞凋亡及肿瘤的发生发展中都起着重要作用。利用GAL4转录因子中的DNA结合结构域 (DBD)和含有与DBD结合序列的荧光素酶报告基因(GAL4 LUC)构建了哺乳动物细胞转录激活系统 ,并利用该系统定位了FHL2的转录激活结构域。首先将GAL4 DBD序列以正确读框插入到pcDNA3载体的多克隆位点中 ,构建成真核表达载体pDBD ,再将野生型FHL2及其不同片段以正确读框与pDBD中GAL4 DBD序列融合 ,构建成野生型FHL2及其缺失突变体表达载体。将这些表达载体分别瞬时转染 2 93T胚胎肾细胞 ,野生型FHL2及其缺失突变体都得到了表达。利用GAL4 荧光素酶报告基因对野生型FHL2及其不同突变体的转录激活活性检测表明 ,在 2 93T胚胎肾细胞和乳腺癌MCF 7细胞中 ,野生型FHL2具有转录激活活性 ,缺失N端半个LIM结构域使FHL2转录激活活性降低 ,缺失C末端第二个LIM结构域对FHL2的转录激活功能影响不大 ,缺失C末端最后一个LIM结构域则使FHL2的转录激活功能完全丧失 ,而C末端缺失 2个LIM结构域使FHL2转录激活活性又有所恢复。这说明FHL2C末端最后一个LIM结构域对其转录激活功能是必需的 ,而C末端第二个LIM结构域可能对FHL2的转录激活功能有负调控作用 ,这种负调控作用取决于     

利用双萤光素酶报告系统研究FoxM1转录活性调控

目的:构建细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)启动子萤光素酶报告系统,用于转录因子FoxM1转录活性调控研究。方法:利用瞬时转染、实时荧光定量PCR及Western印迹,验证人胚肾HEK293细胞中FoxM1对Cyclin B1 mRNA的转录及蛋白表达的调节作用;利用PCR技术从人宫颈癌HeLa细胞基因组中钓取人源Cyclin B1的启动子序列,克隆至pGL3-Basic Vector中,构建含有Cyclin B1启动子的萤火虫萤光素酶报告质粒pGL3-Cyclin B1;通过瞬时转染、Western印迹及萤火虫/海肾萤光素酶双报告系统,研究c-Abl酪氨酸激酶对FoxM1转录活性的调控作用。结果:构建了Cyclin B1萤火虫萤光素酶报告系统,该报告系统可用于FoxM1转录活性研究;c-Abl酪氨酸激酶能够显著抑制FoxM1靶向Cyclin B1启动子的转录活性,且抑制作用依赖c-Abl的激酶活性。结论:pGL3-Cyclin B1萤光素酶报告系统可用于研究c-Abl酪氨酸激酶介导的FoxM1转录活性调节。     

FHL2 蛋白在肿瘤中的转录调控及其分子生物学机制

FHL2是仅有四个半LIM结构域(FHL)蛋白家族的成员,目前在FHL蛋白家族中研究最为广泛。FHL2作为重要的衔接蛋白和支架蛋白,主要通过LIM结构域介导蛋白分子间的相互作用以实现其生物学功能。Fhl2基因在转录水平受多种肿瘤相关基因的调控,如p53,血清应答因子等。FHL2与恶性肿瘤的关系是近年来的研究热点,目前认为FHL2能够作为癌蛋白及抑癌蛋白通过不同机制广泛影响乳腺癌、胃肠道肿瘤、肝癌、前列腺癌等肿瘤的发生发展,并且在不同肿瘤中的表达具有组织特异性。本文就FHL2的结构特点、功能、转录调控及与肿瘤的关系几个方面展开综述,从而明确FHL2在不同肿瘤中所发挥的作用及其分子生物学机制将会为治疗相关肿瘤提供新的干预靶点。     

BRCA1相互作用蛋白的分离及鉴定

乳腺癌易感基因(breast cancer susceptibility gene-1,BRCAl)在DNA损伤修复、细胞周期调控、染色质的稳定、基因转录激活以及细胞凋亡等方面起着重要作用。BRCAI C-末端是富含酸性氨基酸的转录激活结构域(AD),AD核心结构为两个串联的BRCT结构域(BRCTl和BRCT2)。应用酵母双杂交技术,以BRCT2为诱饵蛋白,从卵巢文库中筛选到了与BRCT2结构域相互作用蛋白FHL2(four and half LIM domains)。利用酵母交配的方法证明FHL2与BRCAlBRCT2特异结合,而不与BRCAl BRCTl、Rapl BRCT结构域结合。GST沉淀实验表明,FHL2在体外特异地与BRCT2结构域相结合;免疫共沉淀实验表明,FHL2在体内特异地与BRCT2结构域结合;FHL2可与全长BRCAl结合。BRCAl与FHL2相互作用的发现为研究BRCAl以及FHL2在肿瘤发生、发展中的作用打下了坚实的基础。     

FHL2调控人和动物生殖的研究进展

FHL2是FHL家族成员之一,可作为辅助因子与80余种蛋白质互作。FHL2在哺乳动物卵巢和睾丸中均有表达,通过与转录因子WT-1互作参与动物早期性腺分化,并可能通过与SMAD、TGFβ和WNT等信号通路互作,调控卵巢抑制素α亚基基因(INHA)和P450scc的表达,影响卵泡发育和排卵。FHL2表达异常与多种癌症发生相关,包括乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌和前列腺癌等。进一步开展对FHL2基因的研究,有助于阐明动物生殖调控和相关癌症发病机制,对辅助生殖技术、提高动物繁殖力的新技术和抗癌药物的研发具有积极推动作用。     

FHL1的结构和功能及其与疾病的关系

FHL（four and a half LIM domain）家族是含有4 个半LIM结构域的蛋白家族,现发现该家族由5 个成员,即FHL1、FHL2、FHL3、FHL4、FHL5 /ACT 组成,其表达具有组织特异性.它们通过LIM结构域与某些结构蛋白、激酶、转录调控因子等多种蛋白质相互作用,对某些基因的表达、细胞分化与发育、细胞骨架形成等发挥重要调控作用.FHL1（four and a half LIM domain 1）是FHL家族中表达最广泛的成员,尤其在骨骼肌和心肌中高表达.近年研究表明其参与某些病理过程,与心血管疾病、肌肉疾病、肿瘤疾病等相关.     

FHL2参与调控MCF-7细胞周期

目的：研究FHL2对细胞周期阻滞的影响。方法：应用pSR-GFP/Neo载体构建FHL2-siRNA干扰载体,转染MCF-7细胞,G418筛选稳定细胞系,通过流式细胞仪检测离子辐射后细胞周期的变化。结果：利用设计的FHL2-siRNA干扰载体能够干扰细胞中FHL2的表达;当离子辐射后,FHL2敲除细胞G2/M期阻滞的程度比野生型细胞显著降低。结论：FHL2参与调控MCF-7细胞离子辐射后细胞周期G2/M期阻滞。     

c-Abl蛋白酪氨酸激酶形成同源二聚体

c-Abl是非受体酪氨酸激酶,它在细胞内被一些基因毒性的、氧化的及其它形式的压力所激活。目前研究证明：应用标记的c-Abl发现其在细胞内可以相互形成同源二聚体,并且一分子c-Abl的N末端区域与相应的另一分子的C末端相互作用形成二聚体。实验进一步表明： cAbl SH3 结构域结合到另一c-Abl 分子富含脯氨酸的C-末端约958-982氨基酸区域。如果去除c-Abl 富含脯氨酸的结构域,就会阻止二聚体的形成。这些结果首先证实了c-Abl在细胞内可以相互形成同源二聚体,并暗示着二聚体的形成可能影响着c-Abl活性的调节。