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相似文献
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1.
一种高特异性的改良降落PCR   总被引:3,自引:0,他引:3  
为提高基因组DNA中的基因PCR检出的特异性,设计了一种改良的降落PCR程序,并分别用TaqDNA聚合酶及高保真PfuDNA聚合酶进行实验。自盐藻Dunaliella bardawil中提取基因组DNA作为PCR模板,使用TaqDNA聚合酶及PfuDNA聚合酶,运用普通PCR和降落PCR程序,扩增胡萝眩素生物合成相关基因(cbr)上游启动子序列,并电泳比较PCR扩增产物的特异性。结果显示,使用普通Taq酶PCR,普通PCR程序产生200bp,500bp和1272bp长的三条带,而TD-PCR程序仅克隆出1272bp的特异带;利用高保真的PfuDNA聚合酶作PCR,在TD-PCR泳道中仅有1272bp一条带,而普通PCR除了1272bp的特异带外,还出现一条500bp的非特异带。无论使用普通Taq酶或高保真酶Pfu,改良的降落PCR程序均明显提高PCR的特异性,类似的降落PCR程序可望用于克隆用普通PCR难以克隆的基因片段,或在假阳性难以去除的情况下提高PCR的特异性。  相似文献   

2.
近年来,纳米金粒子对聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)的增效作用倍受关注,但是其具体的机制仍未明确提出。研究发现在PCR反应中,纳米粒子的增效作用是存在最佳浓度的,增加DNA聚合酶或者小牛血清蛋白(BSA)可以消除纳米金粒子导致的抑制。我们认为,纳米金粒子可能起到了类似于聚合酶B亚基的作用,提高了DNA聚合酶的延伸能力;而过量纳米金对PCR的抑制作用可能与纳米金结合单链DNA产生的位阻效应有关。  相似文献   

3.
DNA聚合酶I是在DNA双螺旋结构模型提出后被发现的,阿瑟·科恩伯格在研究过程中起到至关重要的作用。在其研究成果的推动下,大肠杆菌DNA聚合酶I得到进一步揭示,并催生了PCR技术的问世,同时也促进了其他DNA聚合酶的发现。  相似文献   

4.
利用PCR、UT-PCR、克隆及测序等技术,对强直性肌营养不良基因(MT-PK)3′-非翻译区分别用Taq,Taq+Pwo DNA聚合酶进行了扩增、克隆和测序,研究了PCR产物末端组成情况,并比较了上述两种DNA聚合酶对PCR产物末端的影响.结果在用Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物主要得到3′端突出1个A(占67.3%,35/52);在Taq+Pwo DNA聚合酶扩增的PCR产物末端中得到3′端+A的仅占17.4%,而-1的占34.8%,与前者显著不同.表明PCR扩增产物的末端是复杂多样的.  相似文献   

5.
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。传统的PCR引物设计软件基本上忽略了DNA聚合酶与引物/模板的亲和性对PCR效率的影响。为揭示DNA聚合酶与引物/模板的相互作用是否对PCR的效率有影响,通过构建Taq DNA聚合酶与不同序列引物/模板DNA相互作用的三维结构模型,采用MM/GBSA方法计算复合物的结合自由能,以结合自由能为参数,为人血清白蛋白基因(Human Serum Albumin gene,HSA gene)和结核杆菌pyrF基因(Mycobacterium tuberculosis pyrF gene)设计了PCR引物。PCR实验结果表明,引物的PCR效率与结合自由能相关:引物与聚合酶的结合自由能越低,PCR实验的效率相对越高。这说明DNA聚合酶与引物/模板的相互作用对PCR效率有重要影响。因此,引物/模板DNA与聚合酶的结合自由能可以作为PCR引物设计的新参数。  相似文献   

6.
单分子PCR产物错误率分析   总被引:6,自引:0,他引:6       下载免费PDF全文
碱基错配致使PCR扩增产物中存在突变序列.大量模板PCR扩增时突变序列所占的比例较低,对随后进行的PCR产物分析影响不大,但当对微量甚至单个模板DNA扩增时,情况则完全不同.对单分子PCR产物的错误率进行了理论分析,结果表明:根据实验目的和条件,选择忠实性不同的聚合酶是十分关键的.  相似文献   

7.
PCR技术研究进展   总被引:25,自引:0,他引:25  
PCR(Polymerase chain reaction)在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。本文对PCR技术的是新进展作一简要综述,包括:热循环仪的改进,引物的软件设计及网络设计,各种DNA聚合酶体系及其特性,多种PCR(Multiplex PCR),DNAshuffling,PCR芯片,固相PCR和电子PCR(Electronic PCR)的原理和应用。  相似文献   

8.
单分子PCR技术及其应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
常规PCR技术大都以大量DNA分子(一般为105个以上)为模板进行DNA扩增。新近发展起来的单分子PCR技术是一种以极少量DNA分子(1、5或10个分子)为模板进行扩增的技术。在高保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术能扩增出高度一致的DNA;在低保真度DNA聚合酶作用下,单分子PCR技术又能构建出含有大量突变基因的DNA库。该将介绍单分子PCR的基本原理、实验步骤、特点及其应用。  相似文献   

9.
DNA聚合酶Ⅰ是在DNA双螺旋结构模型提出后被发现的,阿瑟·科恩伯格在研究过程中起到至关重要的作用。在其研究成果的推动下,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ得到进一步揭示,并催生了PCR技术的问世,同时也促进了其他DNA聚合酶的发现。  相似文献   

10.
耐热DNA聚合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达   总被引:5,自引:0,他引:5  
用PCR法从水生栖热菌菌株YT-1中扩增耐热DNA聚合酶基因,得到2.5kb的DNA片段t扩增片段重组到pUCl8中测序证实为Taq DNA聚合酶基因,将该片段重组到pBV221温控表达质粒中,在大肠杆菌中表达出94kDa的重组蛋白,100ml培养物的细胞产酶为1.5×105u,表达的蛋白能催化PCR反应的进行。  相似文献   

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